Microscopía STED en el dominio de la frecuencia para la supresión selectiva del ruido de fondo
Un nuevo método suprime el ruido de fondo en la microscopía STED de forma selectiva y eficaz, con potencial para su integración en otras técnicas de escaneo puntual de doble haz
La nanoscopia describe la capacidad de ver más allá del límite óptico generalmente aceptado de 200-300 nm. La microscopía de depleción de emisión estimulada (STED), desarrollada por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, y demostrada experimentalmente por Hell y Thomas Klar en 1999, es una técnica de superresolución para la nanoscopia. La microscopía STED ha progresado considerablemente y se utiliza ampliamente en la investigación práctica. Pero su uso práctico conlleva cierto ruido de fondo indeseable, que afecta negativamente a la resolución espacial y a la calidad de la imagen. En general, este ruido proviene de dos fuentes de señal: (i) la fluorescencia generada por la reexcitación causada por las dosis de luz ultra elevadas del haz de depleción; y (ii) la fluorescencia residual, debida a una depleción insuficiente del haz de inhibición.
Microscopía STED en el dominio de la frecuencia para suprimir selectivamente los fondos en las imágenes biológicas.
Longgang Mulin Graphics
En las últimas décadas se han desarrollado importantes enfoques de eliminación de fondo. Se pueden dividir en tres categorías: dominio temporal, dominio espacial y dominio fasorial. Algunos de estos métodos son de larga data y otros son de desarrollo más reciente. Aunque son métodos potentes para eliminar el ruido indeseable de las imágenes de microscopía STED, todos ellos presentan inconvenientes, como la distorsión de la imagen, los tiempos de adquisición prolongados o la introducción de ruido de disparo. La microscopía STED aún no ha alcanzado todo su potencial.
Como se informa en Advanced Photonics, investigadores de la Universidad de Zhejiang han desarrollado recientemente un nuevo método denominado STED de "diferencia de modulación dual" (dmdSTED) para suprimir los fondos de forma selectiva y eficaz. El método funciona clasificando las señales del dominio espacial en el dominio de la frecuencia, de modo que la fluorescencia no agotada y el fondo inducido por la STED se separan convenientemente de las señales fluorescentes deseadas. Los haces de excitación y agotamiento se cargan respectivamente con diferentes modulaciones en el dominio del tiempo. Al evitar la reexcitación causada por el haz de agotamiento, se puede seleccionar un láser de agotamiento con una longitud de onda más cercana al pico del espectro de emisión de fluorescencia de la muestra, reduciendo así la intensidad de agotamiento requerida.
La versión actual de dmdSTED funciona con una resolución espacial de λ/8, una resolución más alta que la de los métodos de dominio fasorial (por ejemplo, SPLIT, λ/5) que son propensos al ruido de disparo. Teóricamente, la posible pérdida de señal por enfoques en el dominio del tiempo (como el time-gating) puede evitarse con este enfoque. Además, dmdSTED es compatible con escenarios de ondas pulsadas o continuas, y no se requiere hardware para el recuento de fotones individuales relacionados con el tiempo (TCSPC). En comparación con los métodos de dominio espacial, la resolución temporal de dmdSTED no está limitada. Por lo tanto, el dmdSTED es ventajoso en la adquisición de imágenes de microscopía integralmente finas, en resolución espacial, SNR y resolución temporal.
Según el autor principal, Xu Liu, director del Laboratorio Estatal Clave de Instrumentación Óptica Moderna, "este método de dominio de la frecuencia posee un gran potencial para integrarse en otras técnicas de escaneo puntual de doble haz, como la microscopía de saturación de estado excitado (ESSat), la microscopía de agotamiento del estado de carga (CSD), la microscopía de agotamiento del estado de tierra (GSD), etc.". Liu comenta: "Además, puede aceptar más tipos de muestras con características espectrales diferentes a las de los tintes fluorescentes utilizados habitualmente en STED, como algunos puntos cuánticos con un espectro de excitación más amplio."
Nota: Este artículo ha sido traducido utilizando un sistema informático sin intervención humana. LUMITOS ofrece estas traducciones automáticas para presentar una gama más amplia de noticias de actualidad. Como este artículo ha sido traducido con traducción automática, es posible que contenga errores de vocabulario, sintaxis o gramática. El artículo original en Inglés se puede encontrar aquí.
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