La nanotecnología permite visualizar las estructuras del ARN con una resolución casi atómica

Para entender lo que hace una molécula de ARN individual, es necesario descifrar su estructura tridimensional a nivel de los átomos y enlaces moleculares que la componen. Los investigadores han estudiado rutinariamente las moléculas de ADN y proteínas convirtiéndolas en cristales regularmente empaquetados que pueden examinarse con un haz de rayos X (cristalografía de rayos X) u ondas de radio (resonancia magnética nuclear). Sin embargo, estas técnicas no pueden aplicarse a las moléculas de ARN con casi la misma eficacia porque su composición molecular y su flexibilidad estructural les impiden formar cristales con facilidad.

Ahora, una colaboración de investigación dirigida por el doctor Peng Yin, miembro de la Facultad Wyss, en el Instituto Wyss de Ingeniería Inspirada en la Biología de la Universidad de Harvard, y el doctor Maofu Liao, de la Facultad de Medicina de Harvard (HMS), ha dado a conocer un enfoque fundamentalmente nuevo para la investigación estructural de las moléculas de ARN. ROCK, como se denomina, utiliza una técnica nanotecnológica de ARN que permite ensamblar múltiples moléculas de ARN idénticas en una estructura altamente organizada, lo que reduce significativamente la flexibilidad de las moléculas individuales de ARN y multiplica su peso molecular. Aplicado a conocidos modelos de ARN con diferentes tamaños y funciones como puntos de referencia, el equipo demostró que su método permite el análisis estructural de las subunidades de ARN contenidas con una técnica conocida como criomicrografía electrónica (crio-EM). Su avance se publica en Nature Methods.

"ROCK está rompiendo los límites actuales de las investigaciones estructurales del ARN y permite desvelar estructuras tridimensionales de moléculas de ARN a las que es difícil o imposible acceder con los métodos existentes, y con una resolución casi atómica", dijo Yin, que junto con Liao dirigió el estudio. "Esperamos que este avance vigorice muchas áreas de la investigación fundamental y el desarrollo de fármacos, incluido el floreciente campo de la terapéutica del ARN". Yin también es líder de la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss y profesor del Departamento de Biología de Sistemas del HMS.

El control del ARN

El equipo de Yin en el Instituto Wyss ha sido pionero en varios enfoques que permiten a las moléculas de ADN y ARN autoensamblarse en grandes estructuras basadas en diferentes principios y requisitos, como los ladrillos de ADN y el origami de ADN. Su hipótesis es que estas estrategias también podrían utilizarse para ensamblar moléculas de ARN naturales en complejos circulares muy ordenados en los que su libertad de flexión y movimiento está muy restringida al unirlos específicamente. Muchos ARN se pliegan de forma compleja pero predecible, con pequeños segmentos emparejados entre sí. El resultado suele ser un "núcleo" estabilizado y "bucles de tallo" que sobresalen en la periferia.

En nuestro método instalamos "bucles de beso" que enlazan diferentes bucles madre periféricos pertenecientes a dos copias de un ARN idéntico de forma que se pueda formar un anillo global estabilizado que contenga múltiples copias del ARN de interés", explica el doctor Di Liu, uno de los dos primeros autores y becario postdoctoral del grupo de Yin. "Especulamos que estos anillos de orden superior podrían analizarse con alta resolución mediante crio-EM, que se había aplicado a las moléculas de ARN con un primer éxito".

Imaginando el ARN estabilizado

En la crio-EM, se congelan muchas partículas individuales a temperaturas criogénicas para evitar cualquier otro movimiento, y luego se visualizan con un microscopio electrónico y la ayuda de algoritmos computacionales que comparan los diversos aspectos de las proyecciones de la superficie 2D de una partícula y reconstruyen su arquitectura 3D. Peng y Liu se asociaron con Liao y su antiguo estudiante de posgrado, el doctor François Thélot, el otro coprimer autor del estudio. Liao, junto con su grupo, ha hecho importantes contribuciones al campo de la crio-EM, que avanza rápidamente, y al análisis experimental y computacional de partículas individuales formadas por proteínas específicas.

"La crio-EM tiene grandes ventajas sobre los métodos tradicionales a la hora de ver detalles de alta resolución de las moléculas biológicas, incluidas las proteínas, el ADN y el ARN, pero el pequeño tamaño y la tendencia al movimiento de la mayoría de los ARN impiden determinar con éxito las estructuras del ARN. Nuestro novedoso método de ensamblaje de multímeros de ARN resuelve estos dos problemas al mismo tiempo, aumentando el tamaño del ARN y reduciendo su movimiento", dijo Liao, que también es profesor asociado de Biología Celular en el HMS. "Nuestro enfoque ha abierto la puerta a la determinación rápida de la estructura de muchos ARN mediante crio-EM". La integración de la nanotecnología del ARN y los enfoques de crio-EM llevó al equipo a denominar su método "RNA oligomerization-enabled cryo-EM via installing kissing loops" (ROCK).

Para demostrar el principio de ROCK, el equipo se centró en un gran ARN intrón de Tetrahymena, un organismo unicelular, y en un pequeño ARN intrón de Azoarcus, una bacteria fijadora de nitrógeno, así como en el llamado riboswitch FMN. Los ARN intrones son secuencias de ARN no codificantes dispersas en las secuencias de los ARN recién transcritos y tienen que ser "empalmados" para que se genere el ARN maduro. El riboswitch FMN se encuentra en los ARN bacterianos que participan en la biosíntesis de los metabolitos de flavina derivados de la vitamina B2. Al unirse a uno de ellos, el mononucleótido de flavina (FMN), cambia su conformación 3D y suprime la síntesis de su ARN madre.

"El ensamblaje del intrón del grupo I de Tetrahymena en una estructura en forma de anillo hizo que las muestras fueran más homogéneas y permitió el uso de herramientas computacionales aprovechando la simetría de la estructura ensamblada. Aunque nuestro conjunto de datos es relativamente modesto en tamaño, las ventajas innatas de ROCK nos permitieron resolver la estructura con una resolución sin precedentes", dijo Thélot. "El núcleo del ARN se ha resuelto a 2,85 Å [un Ångström es un diez mil millones (US) de metro y la métrica preferida por los biólogos estructurales], revelando características detalladas de las bases de los nucleótidos y de la espina dorsal del azúcar. No creo que hubiéramos podido llegar a ello sin ROCK, o al menos no sin muchos más recursos".

La crio-EM también es capaz de capturar moléculas en diferentes estados si, por ejemplo, cambian su conformación 3D como parte de su función. Aplicando ROCK al ARN del intrón de Azoarcus y al riboswitch de FMN, el equipo consiguió identificar las diferentes conformaciones por las que pasa el intrón de Azoarcus durante su proceso de autoempalme, y revelar la relativa rigidez conformacional del sitio de unión al ligando del riboswitch de FMN.

"Este estudio de Peng Yin y sus colaboradores muestra con elegancia cómo la nanotecnología del ARN puede funcionar como un acelerador para avanzar en otras disciplinas. Ser capaz de visualizar y comprender las estructuras de muchas moléculas de ARN que se producen de forma natural podría tener un impacto tremendo en nuestra comprensión de muchos procesos biológicos y patológicos en diferentes tipos de células, tejidos y organismos, e incluso permitir nuevos enfoques de desarrollo de fármacos", dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., quien también es el profesor Judah Folkman de Biología Vascular en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital Infantil de Boston, y profesor de Bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.