Un nuevo método de microscopía resuelve moléculas fluorescentes con resolución a escala nanométrica
Los científicos que trabajan con Stefan Hell en el Instituto Max Planck (MPI) de Química Biofísica de Gotinga y el MPI de Investigación Médica de Heidelberg han desarrollado otro método de microscopía óptica, denominado MINSTED, que resuelve con nitidez molecular los detalles marcados con fluorescencia. Con MINSTED, el premio Nobel Hell ha cerrado el círculo.
Una comparación de diferentes técnicas de microscopía óptica: STED (abajo a la izquierda) mejora drásticamente la nitidez de los detalles en comparación con la microscopía confocal convencional (arriba a la izquierda). MINSTED (derecha) consigue una resolución aún diez veces mayor.
© Michael Weber / Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie
"Hace unos 20 años, rompimos fundamentalmente el límite de resolución de difracción de la microscopía de fluorescencia con STED. Hasta entonces, eso se consideraba imposible", dice Hell. "Entonces soñábamos: Con la STED queremos llegar a ser tan buenos que un día seamos capaces de separar moléculas individuales que estén separadas sólo por unos pocos nanómetros. Ahora lo hemos conseguido". En aquel momento, el principio STED supuso una revolución en la microscopía óptica. Por este salto conceptual y los desarrollos posteriores, Hell recibió el Premio Nobel de Química en 2014.
En su versión original, la microscopía STED alcanzaba una resolución de 20 a 30 nanómetros (millonésimas de milímetro) y, por tanto, era unas diez veces más nítida que los microscopios de luz disponibles hasta entonces. En 2016, Hell y sus colaboradores consiguieron multiplicar por diez la resolución mediante un nuevo método denominado nanoscopia MINFLUX. En ese nuevo enfoque, combinaron un elemento del principio STED con otro de otra técnica de microscopía óptica, PALM/STORM, y así lograron por primera vez una resolución de unos pocos nanómetros. El MINFLUX puede realmente hacer visibles las moléculas fluorescentes a escala molecular: no hay nada más nítido.
Una nueva familia de microscopios de resolución nanométrica
Hell estaba convencido de que MINFLUX no sería el único método de resolución molecular, sino que representaría el primer miembro de una nueva familia de técnicas con este nivel de detalle. Con MINSTED, él y sus colaboradores están demostrando ahora que esto es cierto. Como su nombre indica, MINSTED se basa en el principio original de STED incluso más que MINFLUX. Michael Weber, estudiante de doctorado en el laboratorio de Hell y uno de los desarrolladores de MINSTED, explica: "Esto tiene ventajas. Al igual que MINFLUX, consigue una resolución molecular, pero el ruido de fondo es menor. Además, la resolución puede ajustarse ahora de forma casi continua desde los 200 nanómetros hasta el tamaño molecular: 1 nanómetro".
Con MINSTED, Hell se basa en su avance con STED de hace más de 20 años y está extrayendo todo el potencial de este concepto. "La microscopía a escala molecular ha llegado para quedarse. Es de esperar que MINSTED y MINFLUX se utilicen ampliamente en las ciencias de la vida", afirma el físico.
Encender y apagar la fluorescencia de las moléculas
STED logró lo que antes era inalcanzable, detectar por separado moléculas separadas por menos de 200 nanómetros, con un truco: Las características fluorescentes o moléculas vecinas se encienden y apagan una tras otra. Para ello, a un haz láser que excita las moléculas le sigue inmediatamente otro, el llamado haz STED, que impide la fluorescencia de las moléculas. El haz STED, sin embargo, tiene un "agujero" en el medio. En otras palabras, tiene forma de donut. Sólo las moléculas que se encuentran en el centro de este haz pueden emitir fluorescencia. Así, siempre se sabe dónde están las moléculas emisoras. En la práctica, STED no consigue una resolución molecular porque el haz de inhibición de fluorescencia en forma de donut no puede hacerse tan fuerte que sólo una molécula pueda caber en el agujero.
Por esta razón, en MINSTED, las moléculas fluorescentes se aíslan inicialmente encendiéndolas al azar mediante un proceso de conmutación fotoquímica independiente, en lugar de hacerlo mediante el propio haz de donuts. A continuación, el haz de donuts STED, que impide la fluorescencia, se utiliza para localizar las moléculas fluorescentes individualmente. Su agujero sirve de punto de referencia. "Si el agujero coincide con la molécula, ésta brilla con mayor intensidad y se puede averiguar con precisión dónde se encuentra, ya que siempre se conoce la posición exacta del haz de donuts STED", explica Marcel Leutenegger, investigador postdoctoral del departamento de Hell. "Por eso nos acercamos gradualmente a las moléculas de forma dirigida con el haz de donuts y podemos así localizar las moléculas fluorescentes con una precisión de 1 a 3 nanómetros, es decir, el tamaño de las moléculas". En relación con el encendido y apagado fotoquímico, la resolución pasa a ser de escala molecular".
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