Supermicroscopio para cristales de proteínas
La combinación de técnicas localiza microcristales para el análisis estructural
Un nuevo tipo de microscopio es capaz de detectar diminutos cristales de proteínas, que están más allá del poder de imagen incluso de los modernos microscopios de luz. La innovadora técnica se basa en diversos efectos ópticos no lineales para obtener imágenes incluso de nanocristales, que se utilizan cada vez más para el análisis de la estructura de las proteínas en la actualidad. El equipo que desarrolló este método, encabezado por Franz Kärtner de DESY, Christian Betzel de la Universidad de Hamburgo y Guoqing Chang de la Academia China de Ciencias, presenta su "microscopio multifotón multimodal" en la revista Communications Biology.
Instalación del microscopio multifotón multimodal en el laboratorio con las trayectorias de los rayos láser trazadas: La fuente de láser se encuentra en el centro de la imagen. El rayo se divide y se convierte en dos longitudes de onda diferentes, que finalmente se reúnen y se dirigen a través del tubo vertical a la muestra.
DESY
La estructura espacial de las proteínas dice a los científicos algo sobre cómo funcionan estas biomoléculas. Esto es importante no sólo para entender los procesos que tienen lugar en el interior de los organismos, sino también para desarrollar nuevos medicamentos. La función de una proteína puede, por ejemplo, ser bloqueada específicamente usando una sustancia activa que está personalizada para unirse al sitio activo de la biomolécula. Para determinar la estructura de las proteínas, los investigadores suelen hacer crecer pequeños cristales de las biomoléculas y hacer brillar rayos X a través de ellos. Los cristales difractan los rayos X, produciendo un patrón característico en el detector. Este patrón de difracción puede utilizarse para calcular la estructura espacial del cristal y, por lo tanto, la de sus bloques de construcción individuales, las proteínas.
Cuanto más brillantes y más estrechamente enfocados sean los rayos X, más pequeños podrán ser los cristales para el análisis estructural. Esta es una gran ventaja, porque muchas proteínas son muy difíciles de crecer como cristales, ya que no es un estado que se supone que ocurra en su entorno natural. En muchos casos, sólo pueden crecer pequeños cristales de tales proteínas. "A medida que las fuentes de rayos X van mejorando, hay una creciente demanda de micro y nanocristales", explica Betzel que, como Kärtner, también es miembro del Centro de Imágenes Ultra-rápidas de Hamburgo, CUI.
El problema al que se enfrentan los investigadores es que primero tienen que encontrar estos diminutos cristales en la suspensión. Sin embargo, los cristales de proteína no sólo son pequeños, sino que suelen ser transparentes y no muy diferentes a los cristales de sal. "Durante años, nos hemos encontrado con los límites de nuestra capacidad para detectar estos diminutos cristales, incluso utilizando microscopios ultramodernos", explica Kärtner, que trabaja en el Centro para la Ciencia del Láser de Electrones Libres, CFEL, que es operado conjuntamente por DESY, la Universidad de Hamburgo y la Sociedad Max Planck. "Estos cristales de proteína, en su mayoría incoloros, son extremadamente difíciles de localizar en soluciones acuosas cuando nos preparamos para realizar mediciones, y a menudo se pasan por alto por completo", añade Qing-di Cheng, uno de los principales autores y estudiante de doctorado de la Universidad de Hamburgo.
Por lo tanto, el equipo de científicos diseñó un microscopio multifotón especial (MPM) para cristales de proteínas. Combina dos efectos diferentes para hacer visibles los sensibles cristales. En primer lugar, hace que los cristales sean fluorescentes. En segundo lugar, utiliza un efecto no lineal, por el que cuando un rayo láser de alta intensidad se dirige a estos cristales, también producen luz a longitudes de onda de medio y un tercio de la radiación entrante, los llamados armónicos superiores. La ventaja es que en ambos casos la imagen que se ve en el microscopio sólo se ilumina en la longitud de onda correspondiente en la que está presente un cristal de proteína, pero no en su entorno.
El nuevo microscopio multifotón utiliza un láser de fibra multicolor especialmente diseñado que genera intensos pulsos de láser ultrasónicos en el rango infrarrojo que duran sólo una décima de una trillonésima de segundo (décimo de picosegundo). Estos pulsos tienen inicialmente una longitud de onda de 1550 nanómetros. Al duplicar la frecuencia, el sistema genera pulsos de láser con la mitad de esa longitud de onda, 775 nanómetros, que se encuentra justo más allá del espectro visible en el infrarrojo cercano. Al mismo tiempo, el sistema también produce pulsos de láser con una longitud de onda de 1300 nanómetros mediante la conversión de longitudes de onda no lineales. La muestra es iluminada por ambos pulsos.
"El microscopio multifotón impulsado por este tipo de fuente de luz ultrarrápida basada en fibras proporciona un medio robusto y rentable de detectar cristales de proteínas utilizando la duplicación de frecuencia, la triplicación de frecuencia y la fluorescencia de tres fotones", dice Hsiang-Yu Chung, becario de postdoctorado en la CFEL y el otro autor principal de la publicación.
Los cristales se hacen ahora visibles mediante tres procesos. Los pulsos de longitud de onda más cortos hacen que ciertos cristales de proteínas emitan pulsos de radiación a la mitad de su longitud de onda, el llamado segundo armónico. En este caso, irradian en el rango ultravioleta (UV) a 387,5 nanómetros. Los pulsos de mayor longitud de onda, a 1300 nanómetros, producen el tercer armónico en la mayoría de los cristales de proteínas, es decir, pulsos con un tercio de la longitud de onda original. La radiación resultante de 433 nanómetros está en el extremo azul del espectro visible.
La longitud de onda más corta también se elige de manera que pueda desencadenar la fluorescencia en el aminoácido triptófano, que se produce en las proteínas. Para ello, los electrones de este aminoácido necesitan absorber tres fotones (partículas de luz) a la vez del pulso del láser. Esto es posible si la densidad de los fotones del láser es lo suficientemente alta. Para que esto sea así, el láser debe estar bien enfocado. Las múltiples absorciones que son de interés y que dan nombre a los microscopios multifotón, sólo pueden tener lugar en el punto focal. Con el nuevo microscopio de proteínas, la fluorescencia resultante se encuentra en el rango de los rayos ultravioleta, mientras que el rayo láser utilizado se encuentra en el rango de los rayos infrarrojos. Esto facilita la separación de la luz producida de la luz entrante, de modo que la radiación procedente de los cristales de proteína puede ser detectada de forma fiable.
La técnica se ha puesto a prueba en el laboratorio utilizando suspensiones que contienen varios microcristales. Se detectaron con fiabilidad pequeños cristales de las proteínas lisozima, taumatina, termolisina y PAK4. "Los microscopios disponibles comercialmente para estas aplicaciones tienen un rendimiento limitado; en particular, son mucho menos sensibles y no pueden distinguir de forma fiable entre los cristales de proteínas y los cristales de sal", dice Chang. "Es probable que el sistema MPM descrito por nosotros atraiga un gran interés dentro de la comunidad de la biología estructural, especialmente en los laboratorios que trabajan en fuentes de rayos X, pero también en instituciones y laboratorios que trabajan en neurobiología, por ejemplo".
Nota: Este artículo ha sido traducido utilizando un sistema informático sin intervención humana. LUMITOS ofrece estas traducciones automáticas para presentar una gama más amplia de noticias de actualidad. Como este artículo ha sido traducido con traducción automática, es posible que contenga errores de vocabulario, sintaxis o gramática. El artículo original en Inglés se puede encontrar aquí.
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