Les chercheurs peuvent mesurer optiquement les distances dans les molécules
La microscopie MINFLUX permet de déterminer les distances au sein des biomolécules à l'aide d'un microscope optique
Une équipe dirigée par les physiciens Steffen Sahl et Stefan Hell de l'Institut Max Planck pour les sciences multidisciplinaires de Göttingen et de l'Institut Max Planck pour la recherche médicale de Heidelberg a réussi à mesurer des distances à l'intérieur de biomolécules à l'aide d'un microscope optique, jusqu'à un nanomètre et avec une précision de l'ordre de l'Ångström. La résolution intra-moléculaire obtenue avec la microscopie MINFLUX permet d'enregistrer optiquement les distances spatiales entre les sous-unités des macromolécules et donc de détecter les différentes conformations des protéines individuelles au microscope optique.
Des polyprolines de différentes longueurs, des polypeptides relativement rigides, ont servi de "règles nanométriques" intramoléculaires pour démontrer les résolutions MINFLUX les plus élevées dans la plage de distance du transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET). Les ellipses à 2 sigmas indiquent l'incertitude de mesure des positions individuelles.
© MPI f. Multidisziplinäre Naturwissenschaften/ Steffen J. Sahl
Deux sous-unités identiques du capteur de citrate bactérien en disposition antiparallèle (en haut) et parallèle (en bas). Les mesures optiques de position en 3D avec MINFLUX permettent de détecter les deux états du dimère formé par les sous-unités en mesurant très précisément les distances entre les molécules fluorescentes aux extrémités de la protéine. Les ellipses indiquent l'incertitude de mesure des deux positions (1, 2 et 3 sigma).
© MPI f. Multidisziplinäre Naturwissenschaften/ Steffen J. Sahl
À quoi ressemble le nanocosmos des cellules vivantes ? La microscopie à fluorescence permet de visualiser des molécules spécifiques dans les cellules ou les tissus et fait désormais partie intégrante de la recherche biologique et médicale fondamentale. Grâce à de nouveaux concepts de nanoscopie de fluorescence à haute résolution, tels que la microscopie MINFLUX, il est possible de séparer des biomolécules très proches les unes des autres à l'aide d'un microscope optique. L'imagerie précise de l'intérieur des cellules est une chose, mais la microscopie à fluorescence peut-elle également être utilisée pour mesurer les détails à l'intérieur des protéines individuelles ou d'autres macromolécules ?
Comme l'ont démontré les chercheurs dirigés par Sahl et Hell, c'est possible. Et cela fonctionne remarquablement bien. Dans leurs derniers travaux, l'équipe a montré que la méthode MINFLUX peut également être utilisée pour mesurer optiquement la distance tridimensionnelle entre deux marqueurs moléculaires fluorescents, chacun attaché à un site spécifique d'une macromolécule, et ce avec une précision de l'ordre de l'Ångström.
Mesurer des distances de quelques nanomètres entre deux molécules fluorescentes ancrées dans l'espace était concevable avec MINFLUX, mais pas si facile à mettre en œuvre ou à démontrer expérimentalement. "À des distances inférieures à 5 ou 10 nanomètres, les molécules fluorescentes, dont la taille est d'environ 1 nanomètre, interagissent souvent entre elles. Par conséquent, elles ne peuvent pas émettre leur lumière de fluorescence indépendamment les unes des autres, ce qui est la condition préalable à une mesure fiable de la distance", explique M. Sahl, auteur principal de l'étude. "Comme beaucoup d'autres, j'ai été fasciné par la haute résolution spatiale et la précision que permet la méthode MINFLUX proposée et développée par Stefan Hell", explique le physicien. "Au début de notre travail, nous avions estimé que les protéines étaient si petites et que nous pouvions en principe atteindre une telle précision. Pourquoi ne réalisons-nous pas des résolutions à l'intérieur d' une biomolécule ?" Car jusqu'à présent, la détection de distances nanométriques entre deux protéines, ou leurs sous-unités, était l'apanage d'une méthode appelée transfert d'énergie par résonance de Förster, ou FRET en abrégé, une méthode standard en biologie structurale et moléculaire.
Avancer dans la gamme FRET
Sahl, Hell et leurs collègues sont maintenant entrés dans cette gamme de résolution grâce à la microscopie MINFLUX. Ils ont utilisé des molécules fluorescentes photoactivables spécialement développées par l'Institut Max Planck pour les sciences multidisciplinaires, qui peuvent être "allumées" l'une après l'autre avec une petite dose de lumière UV, mais qui n'interagissent pas entre elles. Ainsi, les positions à mesurer dans la macromolécule peuvent être marquées par une seule molécule fluorescente et enregistrées indépendamment avec une précision d'Ångström.
"Nous avons montré qu'avec MINFLUX, toutes les distances - jusqu'au contact direct des molécules fluorescentes - peuvent être mesurées. Pour ce faire, il suffit de déterminer les positions des molécules en deux ou trois dimensions, c'est-à-dire en 2D ou en 3D", explique M. Sahl. "Avec nos expériences, nous atteignons la plage de distance de la FRET et allons même au-delà".
Le FRET, quant à lui, estime la distance entre deux molécules de colorant indirectement via le transfert d'énergie d'un colorant à l'autre. Non seulement la distance, mais aussi l'orientation des molécules de colorant affectent le résultat de la mesure. Cela peut entraîner des incertitudes lorsqu'il s'agit de mesurer précisément la distance intramoléculaire. La méthode FRET a également souvent été limitée dans les études de sous-unités protéiques lorsque celles-ci se déplacent en dehors de la plage de distance mesurable. "C'est là que la méthode MINFLUX peut démontrer ses forces en représentant correctement toutes les distances concevables jusqu'à 1 nanomètre sans aucune lacune", explique M. Hell. "MINFLUX est donc un nouvel outil très puissant dans le répertoire de la biologie structurale pour l'étude des protéines et d'autres biomolécules et de leurs interactions.
Des règles moléculaires et des petites molécules de protéines
Pour démontrer la précision de la mesure des distances, l'équipe de recherche a utilisé une molécule avec laquelle la méthode FRET a débuté lors d'une expérience classique dans les années 1960. À l'époque, Lubert Stryer et Richard Haugland ont réussi à confirmer la dépendance de la distance publiée par Theodor Förster en 1948. Pour ce faire, ils ont utilisé des "règles" moléculaires d'une longueur moyenne définie, appelées polyprolines. Les chercheurs de Max Planck ont maintenant utilisé exactement ces règles dans leurs expériences - et ont montré que la méthode peut en principe être utilisée dans les cellules.
En collaboration avec le groupe de recherche de Stefan Jakobs à l'Institut Max Planck des sciences multidisciplinaires, des protéines laminaires marquées par fluorescence dans des cellules humaines, qui forment des filaments d'une épaisseur d'environ 3 nanomètres sur la membrane entourant le noyau cellulaire, ont été imagées séparément à l'aide de la méthode MINFLUX. En outre, les scientifiques ont démontré le potentiel de MINFLUX par des expériences avec d'autres petites protéines, appelées nanocorps, et leurs oligomères. En utilisant des molécules d'anticorps comme exemple, ils ont montré comment les mesures de positions multiples permettent de résoudre la position spatiale des sous-unités protéiques l'une par rapport à l'autre.
En utilisant deux sous-unités identiques du capteur de citrate bactérien, l'équipe, en collaboration avec le département de Christian Griesinger à l'Institut Max Planck pour les sciences multidisciplinaires, a démontré que même des distances de 1 nanomètre peuvent être mesurées. La microscopie MINFLUX a également révélé clairement les deux arrangements structurels des sous-unités avec une précision de l'ordre de 1 Ångström.
M. Hell, qui a reçu le prix Nobel de chimie en 2014 pour le développement de la microscopie à super-résolution, est ravi : "Depuis notre première démonstration du concept MINFLUX en 2016, il a une fois de plus repoussé radicalement les limites de la microscopie optique. La résolution au sein des macromolécules n'était pas vraiment prévisible en 2014."
Note: Cet article a été traduit à l'aide d'un système informatique sans intervention humaine. LUMITOS propose ces traductions automatiques pour présenter un plus large éventail d'actualités. Comme cet article a été traduit avec traduction automatique, il est possible qu'il contienne des erreurs de vocabulaire, de syntaxe ou de grammaire. L'article original dans Anglais peut être trouvé ici.
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