La nanotechnologie permet de visualiser les structures de l'ARN à une résolution quasi atomique

Pour comprendre ce que fait une molécule d'ARN individuelle, sa structure 3D doit être déchiffrée au niveau des atomes et des liaisons moléculaires qui la composent. Les chercheurs ont étudié régulièrement les molécules d'ADN et de protéines en les transformant en cristaux régulièrement emballés qui peuvent être examinés à l'aide d'un faisceau de rayons X (cristallographie aux rayons X) ou d'ondes radio (résonance magnétique nucléaire). Cependant, ces techniques ne peuvent pas être appliquées aux molécules d'ARN avec presque la même efficacité car leur composition moléculaire et leur flexibilité structurelle les empêchent de former facilement des cristaux.

Aujourd'hui, une collaboration de recherche dirigée par Peng Yin, Ph.D., membre de la faculté Wyss Core, à l'Institut Wyss pour l'ingénierie d'inspiration biologique de l'Université de Harvard, et Maofu Liao, Ph.D., à la Harvard Medical School (HMS), a mis en évidence une approche fondamentalement nouvelle de l'étude structurelle des molécules d'ARN. ROCK, comme on l'appelle, utilise une technique de nanotechnologie de l'ARN qui lui permet d'assembler plusieurs molécules d'ARN identiques en une structure hautement organisée, ce qui réduit considérablement la flexibilité des molécules d'ARN individuelles et multiplie leur poids moléculaire. Appliquée à des ARN modèles bien connus, de tailles et de fonctions différentes, l'équipe a montré que sa méthode permet l'analyse structurelle des sous-unités d'ARN contenues avec une technique connue sous le nom de cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Leur avancée est rapportée dans Nature Methods.

"ROCK repousse les limites actuelles des études structurelles de l'ARN et permet de déverrouiller les structures 3D des molécules d'ARN auxquelles il est difficile, voire impossible, d'accéder avec les méthodes existantes, et ce à une résolution quasi atomique", a déclaré Yin, qui a dirigé l'étude avec Liao. "Nous nous attendons à ce que cette avancée revigore de nombreux domaines de la recherche fondamentale et du développement de médicaments, y compris le domaine florissant de la thérapeutique par l'ARN." Yin est également l'un des responsables de l'initiative de robotique moléculaire de l'Institut Wyss et professeur au département de biologie des systèmes de l'HMS.

Maîtriser l'ARN

L'équipe de Yin au Wyss Institute a été à l'origine de diverses approches permettant aux molécules d'ADN et d'ARN de s'auto-assembler en de grandes structures basées sur différents principes et exigences, notamment les briques d'ADN et l'origami d'ADN. L'équipe a émis l'hypothèse que de telles stratégies pourraient également être utilisées pour assembler des molécules d'ARN naturelles en complexes circulaires hautement ordonnés dans lesquels leur liberté de flexion et de mouvement est fortement restreinte en les reliant spécifiquement entre eux. De nombreux ARN se replient de manière complexe mais prévisible, de petits segments s'appariant par base les uns aux autres. Le résultat est souvent un "noyau" stabilisé et des "boucles-tiges" qui s'étendent à la périphérie.

Dans notre approche, nous installons des "boucles embrassantes" qui relient différentes boucles souches périphériques appartenant à deux copies d'un ARN identique d'une manière qui permet la formation d'un anneau global stabilisé, contenant plusieurs copies de l'ARN en question", a déclaré Di Liu, Ph.D., l'un des deux premiers auteurs et chercheur postdoctoral dans le groupe de Yin. "Nous avons supposé que ces anneaux d'ordre supérieur pourraient être analysés avec une haute résolution par la cryo-EM, qui avait été appliquée aux molécules d'ARN avec un premier succès."

Représentation de l'ARN stabilisé

Dans la cryo-EM, de nombreuses particules individuelles sont congelées à des températures cryogéniques pour empêcher tout mouvement ultérieur, puis visualisées à l'aide d'un microscope électronique et d'algorithmes de calcul qui comparent les différents aspects des projections de surface en 2D d'une particule et reconstruisent son architecture en 3D. Peng et Liu ont fait équipe avec Liao et son ancien étudiant diplômé, François Thélot, Ph.D., l'autre co-auteur principal de l'étude. Liao et son groupe ont apporté d'importantes contributions au domaine de la cryo-EM, qui progresse rapidement, et à l'analyse expérimentale et informatique des particules uniques formées par des protéines spécifiques.

"La cryo-EM présente de grands avantages par rapport aux méthodes traditionnelles en permettant de voir les détails à haute résolution des molécules biologiques, notamment les protéines, l'ADN et les ARN, mais la petite taille et la tendance à se déplacer de la plupart des ARN empêchent de déterminer avec succès les structures des ARN. Notre nouvelle méthode d'assemblage de multimères d'ARN résout ces deux problèmes en même temps, en augmentant la taille de l'ARN et en réduisant son mouvement", a déclaré Liao, qui est également professeur associé de biologie cellulaire à HMS. "Notre approche a ouvert la voie à la détermination rapide de la structure de nombreux ARN par cryo-EM". L'intégration de la nanotechnologie de l'ARN et des approches de cryo-EM a conduit l'équipe à nommer sa méthode "cryo-EM par oligomérisation de l'ARN via l'installation de boucles de baiser" (ROCK).

Pour apporter la preuve de principe de ROCK, l'équipe s'est concentrée sur un grand ARN intron de Tetrahymena, un organisme unicellulaire, et un petit ARN intron d'Azoarcus, une bactérie fixatrice d'azote, ainsi que sur le riboswitch FMN. Les ARN introns sont des séquences d'ARN non codantes disséminées dans les séquences d'ARN fraîchement transcrites et doivent être "épissées" pour que l'ARN mature soit généré. Le riboswitch FMN se trouve dans des ARN bactériens impliqués dans la biosynthèse de métabolites de flavine dérivés de la vitamine B2. Lorsqu'il se lie à l'un d'eux, le mononucléotide de flavine (FMN), il change de conformation 3D et supprime la synthèse de son ARN mère.

"L'assemblage de l'intron du groupe I de Tetrahymena en une structure en anneau a rendu les échantillons plus homogènes et a permis d'utiliser des outils de calcul tirant parti de la symétrie de la structure assemblée. Bien que notre ensemble de données soit de taille relativement modeste, les avantages innés de ROCK nous ont permis de résoudre la structure à une résolution sans précédent", a déclaré M. Thélot. "Le cœur de l'ARN est résolu à 2,85 Å [un Ångström correspond à un dix-milliard de mètres (US) et est la mesure préférée des biologistes structurels], révélant les caractéristiques détaillées des bases nucléotidiques et du squelette de sucre. Je ne pense pas que nous aurions pu en arriver là sans ROCK - ou du moins pas sans des ressources considérablement plus importantes."

La cryo-EM est également capable de capturer des molécules dans différents états si, par exemple, elles changent de conformation 3D dans le cadre de leur fonction. En appliquant ROCK à l'ARN de l'intron d'Azoarcus et au riboswitch FMN, l'équipe a réussi à identifier les différentes conformations par lesquelles l'intron d'Azoarcus transite au cours de son processus d'auto-épissage, et à révéler la rigidité conformationnelle relative du site de liaison au ligand du riboswitch FMN.

"Cette étude de Peng Yin et de ses collaborateurs montre de manière élégante comment la nanotechnologie de l'ARN peut servir d'accélérateur pour faire progresser d'autres disciplines. La possibilité de visualiser et de comprendre les structures de nombreuses molécules d'ARN naturelles pourrait avoir un impact considérable sur notre compréhension de nombreux processus biologiques et pathologiques dans différents types de cellules, de tissus et d'organismes, et même permettre de nouvelles approches en matière de développement de médicaments", a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., qui est également professeur de biologie vasculaire Judah Folkman à la Harvard Medical School et au Boston Children's Hospital, et professeur de bioingénierie à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.