PCR: Activado por la luz
Un nuevo enfoque podría ayudar a mejorar significativamente las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR
Las ADN polimerasas y otras enzimas que modifican el ADN son herramientas esenciales en biotecnología y diagnóstico. Son el componente clave para el diagnóstico de COVID-19 por PCR. Por muy útiles que sean, las enzimas que procesan el ADN suelen tener importantes defectos. Algunas de ellas presentan una actividad significativa durante la preparación de las muestras, mientras que otras tienen actividades secundarias desagradables. Ambas pueden conducir a la pérdida de especificidad y sensibilidad, lo que debe evitarse en una prueba de diagnóstico.
© Vera / LMU
El truco consiste en bloquear cualquier tipo de actividad enzimática hasta que se inicie el ensayo. En el caso de las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR, como la mencionada prueba de COVID-19, la solución es el desarrollo de una enzima de arranque en caliente, que no muestra actividad hasta que se alcanza una temperatura de activación elevada. El principal inconveniente de estos enfoques de arranque en caliente es que no pueden utilizarse para enzimas dañadas por el calor, afirma el bioquímico de la LMU Andrés Vera. "Además, el diseño de una enzima de arranque en caliente es tedioso y el agotador proceso de diseño tiene que repetirse para cada nueva enzima que queramos diseñar".
Junto con Merve-Zeynep Kesici, del grupo del profesor Philip Tinnefeld en el Departamento de Química de la LMU, Andrés encontró una forma de evitar estos problemas al diseñar enzimas de arranque en caliente. Sus enzimas de arranque por luz se bloquean hasta que un pulso de luz ultravioleta las reactiva. "Las enzimas controladas por luz existen desde hace tiempo, pero lo que hace que nuestro enfoque sea único es que puede aplicarse a prácticamente cualquier enzima de procesamiento de ADN. En el pasado siempre se necesitaba información muy detallada sobre el funcionamiento de la enzima y nunca se estaba seguro de poder dar con una forma inteligente de bloquear la enzima y reactivarla con luz", dice Vera, líder del proyecto.
En su planteamiento, los investigadores unieron un trozo de ADN a la propia enzima, que compite en exceso con cualquier otro sustrato enzimático haciendo que la enzima quede efectivamente inactiva (incluidas sus actividades secundarias). El pulso de luz se utiliza para cortar el ADN unido a la enzima, lo que da como resultado una enzima 100% activa. La principal ventaja es que el mecanismo debería funcionar para una amplia gama de enzimas de oferta de ADN, independientemente de su forma de acción específica.
Para demostrarlo, los investigadores produjeron cuatro versiones activables por luz de diferentes enzimas de procesamiento de ADN. Entre ellas se encontraba la llamada ADN polimerasa Phi29, una enzima ampliamente utilizada para amplificar genomas enteros, pero demasiado sensible al calor para adaptarse a los métodos de arranque en caliente. Además, el equipo mostró la PCR de arranque ligero y demostró que sus ADN polimerasas eran tan buenas o mejores en comparación con las enzimas comerciales de arranque en caliente para la PCR. Philip Tinnefeld valora positivamente este nuevo avance: "Esto va a ayudar definitivamente a producir mejores enzimas para uso biotecnológico y de diagnóstico. Además, las actuales máquinas de PCR en tiempo real ya incorporan fuentes de luz y podrían modificarse fácilmente para introducir estas enzimas en el mercado en cualquier momento."
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