Primeira imagem de um transposão retro em ação
Avanço com resolução sub-nanométrica
Pela primeira vez, os cientistas conseguiram visualizar um retrotransposão no interior da célula de um organismo complexo. Utilizando a tomografia crioelectrónica de última geração (crio-ET), esta descoberta foi conseguida com uma resolução sub-nanométrica. O estudo publicado na revista Cell mostra como o retrotransposão copia passa pelo seu ciclo de replicação e entra no núcleo da célula através dos poros nucleares. O trabalho foi realizado em colaboração com Sven Klumpe, que em breve criará o seu próprio grupo de investigação como bolseiro conjunto do IMP e do IMBA e trabalha atualmente no MPI de Bioquímica em Martinsried, e com o grupo de Julius Brennecke no IMBA, entre outros.
Estrutura do capsídeo do retrotransposão copia.
© Sven Klumpe
Há uma corrida ao armamento nas nossas células: os transposões - também conhecidos como genes saltadores ou elementos genéticos móveis - podem multiplicar-se e reinserir-se no genoma. Ao fazê-lo, põem em risco a integridade do genoma, desencadeando rearranjos e mutações do ADN. Em contrapartida, as células protegem o seu genoma com mecanismos de defesa complexos que impedem os transposões de saltar. Agora, pela primeira vez, um retrotransposão foi observado "em ação" diretamente numa célula: Ao aperfeiçoar as técnicas de crio-ET, os cientistas visualizaram o retrotransposão copia nos ovários da mosca da fruta Drosophila melanogaster com uma resolução sub-nanométrica.
A equipa internacional responsável por este trabalho inclui também três investigadores com ligações ao BioCenter de Viena: Sven Klumpe, atualmente no laboratório de Jürgen Plitzko no Instituto Max Planck de Bioquímica em Martinsried, que criará um grupo de investigação como bolseiro conjunto no IMBA e no IMP; Julius Brennecke, chefe de grupo sénior no IMBA; e Kirsten Senti, investigadora do grupo de Brennecke. O grupo de Martin Beck no Instituto Max Planck de Biofísica em Frankfurt também está envolvido. O artigo será publicado em 5 de março na revista científica Cell.
A tomografia de crioelectrões é uma técnica de imagem com a qual as estruturas celulares podem ser visualizadas tridimensionalmente a nível molecular. Uma série de imagens 2D são obtidas de diferentes ângulos e combinadas para criar um modelo 3D pormenorizado. A crio-ET fornece uma visão única da ultra-estrutura das células. No entanto, até à data, o método tem sido utilizado principalmente em organismos unicelulares, uma vez que as amostras para a crio-ET têm de ser protegidas da formação de cristais de gelo por congelação rápida - "vitrificação". Os tecidos multicelulares requerem congelação a alta pressão e são muitas vezes demasiado espessos para os métodos de preparação de crio-ET normais.
O capsídeo assemelha-se ao capsídeo do VIH-1
No novo estudo, os investigadores utilizaram o "cryo-lift-out", uma técnica que pode ser utilizada para preparar tecidos complexos para a crio-ET. Esta técnica envolve a utilização de feixes de iões focalizados e uma micromanipulação precisa em condições criogénicas. Aplicando este método a ovários de Drosophila melanogaster e a células deles isoladas, os investigadores reconstruíram a estrutura do capsídeo do retrotransposão copia com uma resolução de 7,7 Å - a primeira estrutura de um retrotransposão com resolução sub-nanométrica no seu ambiente celular natural.
Graças aos recentes avanços na análise estrutural assistida por IA, a equipa criou um modelo integrativo do capsídeo utilizando o AlphaFold 2. Com base neste modelo, desenvolveram experiências orientadas para a estrutura. Estas mostraram que o capsídeo do retrotransposão copia se dobra de forma semelhante ao capsídeo do HIV-1 maduro - confirmando observações anteriores com amostras purificadas.
Klumpe e colegas também conseguiram captar imagens do ciclo de replicação do copia em câmaras de ovos intactas. À semelhança dos retrovírus, os retrotransposões são transcritos a partir do genoma, os transcritos são exportados para o citoplasma e traduzidos em partículas semelhantes a vírus, onde o seu genoma de ARN é finalmente transcrito de forma inversa. No entanto, um quebra-cabeças central na investigação dos retrotransposões é a forma como estes regressam ao núcleo da célula, onde se inserem no genoma.
Conhecimento do ciclo de vida dos retrotransposões
A análise do capsídeo da copia nas células mostrou que as partículas virais estão localizadas no citoplasma, muito próximas dos poros nucleares que ligam o citoplasma ao núcleo. À semelhança do HIV-1, evolutivamente relacionado, a copia parece passar através dos poros nucleares para o núcleo da célula como uma partícula intacta. Aqui, o complexo de poros nucleares actua aparentemente como uma peneira molecular: apenas partículas de um determinado tamanho podem entrar. A interrupção do transporte ativo por manipulação genética resultou na permanência de partículas de copia no citoplasma.
Embora existam muitos retrotransposões no genoma da Drosophila, o copia é de longe o mais frequentemente expresso. Trabalhos anteriores mostraram que copia tem como alvo principal a linha germinativa masculina. O novo estudo também investigou a forma como o sistema de repressão de transposões em Drosophila, a chamada via do piRNA, reprime a copia. Um número particularmente elevado de piRNAs anti-sentido contra copia foi encontrado nos testículos da mosca da fruta. Nas moscas da fruta com uma via de piRNA desactivada, em que os transposons são expressos sem impedimentos, os investigadores encontraram copia nas moscas fêmeas, especialmente nos núcleos germinativos, que mais tarde não entram no material genético do óvulo e morrem de forma programada. No entanto, nas moscas macho, os retrotransposons copia migram do citoplasma para o núcleo da célula germinativa durante a espermatogénese - uma indicação de que a entrada no núcleo é um passo essencial no ciclo de replicação, adaptado ao nicho de copia: o testículo masculino.
"Os transposões foram durante muito tempo considerados ADN lixo, mas têm efeitos de grande alcance na biologia e na evolução dos organismos que os acolhem. O nosso estudo mostra o potencial da crio-ET para explorar a biologia estrutural celular dos transposões e para obter conhecimentos mais profundos sobre os mecanismos biológicos celulares dos seus ciclos de replicação", afirma Klumpe. Julius Brennecke, chefe de grupo sénior do IMBA, aguarda com expetativa as novas oportunidades decorrentes da mudança de Klumpe para o IMBA e o IMP: "A tomografia crioelectrónica pode ser aplicada a muitas questões e Sven terá inúmeras oportunidades de colaboração no BioCenter de Viena."
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Publicação original
Sven Klumpe, Kirsten A. Senti, Florian Beck, Jenny Sachweh, Bernhard Hampoelz, Paolo Ronchi, Viola Oorschot, Marlene Brandstetter, Assa Yeroslaviz, John A.G. Briggs, Julius Brennecke, Martin Beck, Jürgen M. Plitzko; "In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryoelectron tomography"; Cell
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