Microscopía: superación del límite de resolución tradicional para el co-rastreo rápido de moléculas
Los investigadores han desarrollado un método innovador para seguir simultáneamente procesos dinámicos rápidos de múltiples moléculas a escala molecular
Los procesos corporales se caracterizan por la interacción de diversas biomoléculas, como las proteínas y el ADN. Estos procesos se producen a una escala que a menudo se sitúa en un rango de unos pocos nanómetros. Por consiguiente, no pueden observarse con microscopía de fluorescencia, que tiene un límite de resolución de unos 200 nanómetros debido a la difracción. Cuando dos colorantes que marcan posiciones de biomoléculas están más cerca que este límite óptico, su fluorescencia no puede distinguirse al microscopio. Como esta fluorescencia se utiliza para localizarlas, resulta imposible determinar con precisión sus posiciones.
Este límite de resolución se ha superado tradicionalmente en los métodos de microscopía de superresolución haciendo que los colorantes parpadeen y encendiendo y apagando su fluorescencia. Esto separa temporalmente su fluorescencia, haciéndola distinguible y permitiendo localizaciones por debajo del límite de resolución clásico. Sin embargo, para aplicaciones que implican el estudio de procesos dinámicos rápidos, este truco tiene un inconveniente importante: el parpadeo impide la localización simultánea de múltiples colorantes. Esto disminuye significativamente la resolución temporal cuando se investigan procesos dinámicos en los que intervienen múltiples biomoléculas.
Bajo la dirección del profesor Philip Tinnefeld, químico de la LMU, y en colaboración con el profesor Fernando Stefani (Buenos Aires), los investigadores de la LMU han desarrollado ahora la multiplexación pMINFLUX, un enfoque elegante para abordar este problema. El equipo acaba de publicar un artículo sobre su método en la revista Nature Photonics. MINFLUX es un método de microscopía de superresolución que permite realizar localizaciones con una precisión de tan sólo un nanómetro. A diferencia del MINFLUX convencional, el pMINFLUX registra la diferencia de tiempo entre la excitación de los tintes con un pulso láser y la fluorescencia subsiguiente con una resolución de subnanosegundos. Además de localizar los colorantes, esto permite conocer otra propiedad fundamental de su fluorescencia: su tiempo de vida. Esta propiedad describe el tiempo medio que tarda una molécula de colorante en emitir fluorescencia tras ser excitada.
"El tiempo de vida de la fluorescencia depende del colorante utilizado", explica Fiona Cole, coautora de la publicación. "Aprovechamos las diferencias en los tiempos de vida de la fluorescencia al utilizar distintos colorantes para asignar los fotones fluorescentes al colorante que emitía sin necesidad de parpadear y con la consiguiente separación temporal". Para ello, los investigadores adaptaron el algoritmo de localización e incluyeron un modelo de ajuste multiexponencial para lograr la separación requerida. "Esto nos permitió determinar la posición de múltiples colorantes simultáneamente e investigar procesos dinámicos rápidos entre múltiples moléculas con precisión nanométrica", añade Jonas Zähringer, también coautor del trabajo. Los investigadores demostraron su método rastreando con precisión dos cadenas de ADN mientras saltaban entre distintas posiciones en una nanoestructura de origami de ADN, así como separando los movimientos de traslación y rotación de una nanoestructura de origami de ADN y midiendo la distancia entre los sitios de unión a antígenos de los anticuerpos. "Pero esto es sólo el principio", afirma Philip Tinnefeld. "Estoy seguro de que la multiplexación pMINFLUX, con su alta resolución temporal y espacial, proporcionará en el futuro nuevos conocimientos sobre las interacciones entre proteínas y otros fenómenos biológicos".
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