Experiment im schwebenden Tropfen

Proteine: Die Struktur ist entscheidend

Proteine befinden sich in den Zellen jedes lebenden Wesens. Insgesamt gibt es eine unüberschaubare Anzahl verschiedenartiger Proteine, die im Organismus ebenso vielfältige Aufgaben übernehmen. Die jeweilige Funktion eines Proteins hängt dabei stark mit seiner Struktur zusammen: Der Form, in der die Proteinbausteine zueinander ausgerichtet sind. Eine genaue Kenntnis der Proteinstruktur ist daher entscheidend, um beispielsweise massgeschneiderte medizinische Wirkstoffe entwickeln zu können.

An sich ist die Röntgenstrukturanalyse – auch Röntgenkristallografie genannt – ein etabliertes Verfahren. Hierfür werden zunächst aus vielen Exemplaren eines Proteins mikrometerkleine Kristalle gezüchtet. Diese müssen auf tiefe Temperaturen von rund minus 170 Grad Celsius gekühlt werden und lassen sich dann mit einem sehr feinen und sehr intensiven Röntgenstrahl untersuchen. Einen solchen Strahl liefern weltweit nur wenige Anlagen, darunter die Synchrotron Lichtquelle Schweiz SLS am PSI. Die in der Probe abgelenkte Röntgenstrahlung enthält Informationen über die Anordnung der Atome und demnach über die Struktur des jeweiligen Proteins. Um diese Informationen auszuwerten, wird die Strahlung von einem Detektor registriert und schliesslich per Computer analysiert. An der SLS sind drei der mehr als 20 Messplätze auf die Röntgenstrukturanalyse spezialisiert. Hier konnte auf diese Art in den vergangenen zehn Jahren die Struktur von rund 4000 verschiedenen Proteinen entschlüsselt werden.

Gesucht und gefunden: Untersuchungsmethode bei Raumtemperatur

„Das Problem bei dieser Methode ist die notwendige Kühlung der Proteinkristalle“, erklärt der Biologe Tomizaki. Diese erfolgt, damit die Proteine im Kristall keinen Schaden durch die Röntgenstrahlung nehmen. Allerdings: „Keiner kann garantieren, dass bei rund minus 170 Grad Celsius die Proteine weiterhin ihre komplett natürliche Struktur haben – also die Struktur, die sie bei Körpertemperatur im Organismus haben.“ Daher suchten er und der Physiker Soichiro Tsujino nach einer alternativen Methode, die bei Raumtemperatur funktionieren würde und somit sehr nahe an den Bedingungen im Organismus.

So kamen die beiden Wissenschaftler auf die Idee, einen kleinen Flüssigkeitstropfen mitsamt darin befindlichem Proteinkristall in den Röntgenstrahl zu bringen. Einen Tropfen von wenig mehr als einem Millimeter Durchmesser – 4 Mikroliter Flüssigkeit – tropften die Forscher oberhalb einer speziellen Platte in die Luft, die sie mittels Ultraschall gezielt zum Schwingen und damit den Tropfen zum Schweben brachten. An der Strahllinie für makromolekulare Kristallografie der SLS gelang es den Forschern, in diesem Tropfen die Struktur eines Proteins bei Raumtemperatur zu analysieren.

Mit der Methode des schwebenden Tropfens haben sie zugleich eine zweite Schwierigkeit gelöst: die Handhabung der winzigen Proteinkristalle. Bei der klassischen Strukturanalyse müssen sie mühsam auf einem Probenhalter befestigt werden. Tsujino und Tomizaki hatten es einfacher: Das Züchten von Proteinkristallen erfolgt in einer Proteinlösung. Die beiden Wissenschaftler nahmen einfach mit der Pipette einen Tropfen dieser Lösung mitsamt darin befindlichem Kristall auf.

„Die Einfachheit unserer Methode macht sie zugleich zu einer sehr kostengünstigen Prozedur. Beides werden externe Wissenschaftler, die an die SLS kommen, um die Struktur von Proteinen zu ermitteln, sehr zu schätzen wissen“, sagt Tsujino voraus.

Extrem schnelle Detektoren machen es möglich

Die Idee, eine Probe im Inneren eines dank Ultraschall schwebenden Flüssigkeitstropfens zu untersuchen, ist nicht ganz neu. Doch eine erfolgreiche Röntgenstrukturanalyse eines Proteins war bislang noch keinem Forschungsteam geglückt.

„Auch wir konnten bei diesem Unterfangen nur deshalb erfolgreich sein, weil uns an unserer Strahllinie an der SLS Detektoren mit extrem schneller Datenverarbeitung zur Verfügung stehen“, sagt Tsujino. Denn der im Tropfen schwimmende Kristall bleibt nicht fix ausgerichtet, sondern bewegt sich und dreht sich konstant und unkontrolliert um die eigene Achse. Bei der klassischen Röntgenstrukturanalyse erhält man zunächst ein Bild von einzelnen, leuchtenden Punkten. Aus der Lage dieser Punkte lässt sich die Struktur des Proteins berechnen. „Doch durch die kontinuierliche Drehung des Kristalls im Tropfen verschmieren diese Punkte eigentlich zu Linien – an eine klassische Strukturanalyse ist dann nicht zu denken“, erklärt Tsujino. Hier brachten die ultraschnellen Detektoren der Firma DECTRIS – ein Spin-off des PSI – die Lösung: Mit dem Detektor EIGER X 16 M konnten die Forscher 133 Bilder pro Sekunde aufnehmen. Die einzelne Belichtungsdauer war damit so kurz, dass der Kristall wie eingefroren wirkte. Vergleichen kann man dies mit der Fotografie eines Sportlers: Auch hier sind kurze Belichtungszeiten gefragt, damit der Sportler auf dem Bild nicht verschwommen erscheint.

Unkontrollierte Kristallbewegung als doppelter Vorteil

Auch dass die Kristallbewegung im Inneren des Tropfens völlig unkontrolliert geschieht, war für die Forschenden kein Problem: Die vom Kristall gebeugte – d. h. abgelenkte – Strahlung enthält auch Informationen über den Winkel, unter dem der Kristall beleuchtet wurde. Im Gegenteil erwies sich die Drehung des Kristalls als vorteilhaft: Nach mehreren Tausend aufgenommenen Bildern war der Kristall zuverlässig von allen Seiten beleuchtet worden, sodass eine perfekte Strukturanalyse möglich war. „Tausende von Bildern klingt zwar nach viel, doch dank der schnellen Bildverarbeitung unserer Detektoren benötigen wir dafür nur etwa eine halbe Minute“, so Tsujino. „Demnächst wollen wir das Experiment noch mit einem anderen Detektor wiederholen, dem EIGER 1M, der dreitausend Bilder pro Sekunde verarbeiten kann. Damit könnten wir alle benötigten Daten innerhalb von rund einer Sekunde aufnehmen.“

Die ständigen Drehungen und Bewegungen des Kristalls im Tropfen waren zudem der Grund, weshalb die Messung bei Raumtemperatur durchgeführt werden konnte: Der Durchmesser des Röntgenstrahls ist mit 10 Mikrometern deutlich kleiner als die Proteinkristalle, die mit etwa 200 Mikrometern rund doppelt so gross sind wie der Durchmesser eines menschlichen Haares. Dadurch trifft der Strahl immer nur einen kleinen Teil des Kristalls. Die kontinuierliche Kristallbewegung sorgt dafür, dass kein Bereich lange genug der Strahlung ausgesetzt ist, um Schaden zu nehmen.

„Sicherlich könnten wir auch einen Probenhalter bauen, der eine ähnlich schnelle Drehung und Bewegung des Kristalls ausführt. – Aber wozu, wenn der im Tropfen schwebende Kristall das ganz von alleine und viel kostengünstiger macht?“, so Tsujino lachend.

Erfolgsbeweis mit bekanntem Protein

Die Tauglichkeit ihrer neuen Methode konnten Tsujino und Tomizaki an dem Protein Lysozym demonstrieren: Dessen Struktur ist bereits dank klassischer Röntgenstrukturanalyse bekannt. Die Struktur, die die beiden Forscher nun in ihrem schwebenden Tropfen ermittelten, konnten sie im Vergleich als korrekt bewerten.

Die Forschenden konnten auch zeigen, dass die Proteine bei ihrer Methode tatsächlich keinen Strahlungsschaden nahmen.

Zusammenarbeit mit Spin-Off des PSI

Inzwischen arbeiten Tsujino und Tomizaki auch mit einem weiteren Spin-Off-Unternehmen des PSI zusammen: Der leadXpro AG mit Sitz im PARK innovAARE auf dem PSI-Gelände. Die Mitarbeiter von leadXpro waren fasziniert davon, dass die Methode der beiden PSI-Forscher die benötigte Dauer für die Röntgenstrukturanalyse eines Proteins deutlich verkürzt. Gemeinsam wollen die PSI-Forscher und die Wissenschaftler von leadXpro nun die neue Methode weiterentwickeln. Diese konkrete Zusammenarbeit wird aktuell für zweieinhalb Jahre von der Schweizer Kommission für Technologie und Innovation (KTI) gefördert.