Neue Methode zum Nachweis von RNA-Viren wie SARS-CoV-2

Eine wirksame und schnellere Methode als der PCR-Test

01.03.2023 - Spanien

Experten der Universität Barcelona, des Institute for Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), des Institute of Microelectronics of Barcelona (IMB-CNM-CSIC) und des Aragon Nanoscience and Materials Institute of Aragon (INMA) - ein gemeinsames Institut des CSIC und der Universität Zaragoza - haben eine neue Methode zum Nachweis von RNA-Viren entwickelt, die auf der Triplex-bildenden Sondentechnologie basiert. Diese innovative Methodik eröffnet neue Möglichkeiten für den Nachweis von Viren wie SARS-CoV-2, dem Influenza-A-Virus (H1N1) oder dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), einem Erreger, der Neugeborene befällt und eine sorgfältige Differenzialdiagnose erfordert.

Diese interdisziplinäre Studie, die im International Journal of Molecular Sciences veröffentlicht wurde, wird von Carlos J. Ciudad und Verónica Noe von der Fakultät für Pharmazie und Lebensmittelwissenschaften und dem Institut für Nanowissenschaften und Nanotechnologie (IN2UB) der Universität Barcelona geleitet; Ramón Eritja, Anna Aviñó, Lluïsa Vilaplana und M. Pilar Marco vom IQAC-CSIC und dem CIBER für Bioengineering, Biomaterialien und Nanomedizin (CIBER-BBN); Manuel Gutiérrez, Antoni Baldi und César Fernández vom IMB-CNM-CSIC sowie Valeria Grazu und Jesús Martínez, CSIC-Forscher am Institut für Nanowissenschaften und -materialien und Aragón INMA (CSIC-UNIZAR) und dem CIBER-BBN.

Die Studie wurde im Rahmen des PoC4CoV-Projekts durchgeführt, das von M. Pilar Marco und César Fernández geleitet und über die Global Health Platform (PTI) des CSIC finanziert wird. Die Forschungsstudie wurde im Rahmen eines von La Marató de TV3 2020 finanzierten Projekts zur Bekämpfung von COVID-19 fortgesetzt, an dem auch Experten der Fakultät für Chemie der UB beteiligt sind.

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Polypurine Haarnadeln zum Abfangen viraler RNA

Die neue Methode basiert auf der Fähigkeit von Polypurin-Haarnadeln (PPRHs), die von der Krebstherapiegruppe der UB entwickelt wurden, virale RNA einzufangen und eine hochaffine Triplex zu bilden. Wenn diese Hybridstruktur mit einer molekularen Sonde verbunden und mit der Probe des betroffenen Patienten in Kontakt gebracht wird, erhält man ein Nachweissignal für den viralen Erreger. Die in der wissenschaftlichen Veröffentlichung vorgestellte Methode wird Triplex Enhanced Nucleic Acid Detection Assay (TENADA) genannt.

"PPRHs sind unmodifizierte einzelsträngige DNA-Haarnadeln, die aus zwei spiegelnden Domänen aus antiparallelen Polypurinen bestehen. Diese Domänen, die durch eine Thymidinschleife miteinander verbunden sind, sind durch intramolekulare Umkehr-Hoogsteen-Bindungen verknüpft. Die molekularen Haarnadeln können über Watson-Crick-Bindungen spezifisch an Polypyrimidin-Sequenzen in einzelsträngiger DNA (ssDNA), doppelsträngiger DNA (dsDNA) oder RNA-Viren binden und so einen antiparallelen Triplex bilden", sagt Professor Carlos J. Ciudad vom Department für Biochemie und Physiologie der UB.

Eine wirksame und schnellere Methode als der PCR-Test

Ein Vorteil beim Nachweis viraler RNA ist, dass die PPRH-Methode ohne den Einsatz von reverser Transkriptase - dem Enzym, das RNA in DNA umwandelt - oder des Thermocyclers (dem Gerät, das Proben von genetischem Material mit der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR verstärkt) angewendet werden kann. Darüber hinaus ist die Sensitivität und Spezifität des Tests gleichwertig mit der des PCR-Tests und er liefert Ergebnisse in weniger als einer Stunde.

Im Rahmen der Studie verwendete das Team die Sandwich-Hybridisierungsstrategie in mehreren Biodetektionsgeräten. Bei dieser Strategie werden zwei Oligonukleotide verwendet: eine Triplex-bildende PPRH-Haarnadel als Einfangsonde und ein markiertes Duplex-bildendes DNA-Oligonukleotid als Nachweissonde.

"Die triplexbildenden PPRH-Haarnadeln wurden so konzipiert, dass sie an SARS-CoV-2-Polypyrimidin-Sequenzen binden, während die Nachweissonden so konzipiert wurden, dass sie komplementär zu einer Region nahe der Zielstelle der Polypyrimidine sind. Auf diese Weise wird das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA durch die Bildung eines ternären Komplexes auf der Oberfläche des Biosensors nachgewiesen", erklärt Professor Verónica Noé (UB-IN2UB).

Diese Methode wurde in einem kompakten elektrochemischen Gerät umgesetzt, das eine elektrochemische Zelle mit zwei Elektroden auf einem Chip - hergestellt im IMB-CNM-CSIC-Reinraum für Mikro- und Nanofabrikation - und eine Fluidikkomponente auf Papier integriert, sowie in einem thermischen Lateral-Flow-System, das in Nitrocellulose implementiert ist und plasmonische Nanopartikel und Thermopapier verwendet, das am INMA (CSIC-UNIZAR) entwickelt wurde.

TENADA: Anwendungen in der biomedizinischen Forschung

PPRHs werden in der wissenschaftlichen Literatur als Werkzeuge für das Gen-Silencing verschiedener Gene beschrieben, die hauptsächlich an Krebs beteiligt sind. Darüber hinaus wurden sie auch als Sonden in Biosensoren für den Nachweis kleiner RNA-Moleküle (miRNA) zur Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus und für die Diagnose von Lungenentzündungen durch den Pilz Pneumocystis jirovecii eingesetzt .

Nun erweist sich die neue TENADA-Methode nicht nur beim Nachweis von Viruspartikeln als wirksam. Die hohe Affinität der PPRHs für virale RNA ist eine Eigenschaft, die zur Hemmung des Virusreplikationsprozesses genutzt werden kann. Aus diesem Grund werden nun auch die antiviralen Eigenschaften der Polypurin-Hairpin-Clips CC1PPRH und CC2PPRH in Zellen der VeroE6-Linie, die mit SARS-CoV-2-Viren infiziert sind, untersucht.

Die von den verschiedenen beteiligten Gruppen durchgeführten Arbeiten bildeten auch die Grundlage für eine Technologie, die im Juli 2022 unter Beteiligung des UB-Patentzentrums, des CSIC und des CIBER-BBN patentiert und lizenziert wurde. Darüber hinaus wurde dieses Patent auf nicht-exklusiver Basis an das spanische Unternehmen Nanoinmunotech lizenziert, und zwar durch die Verwaltung der Stiftung Bosch i Gimpera (FBG-UB) im Rahmen des Schutzes der Technologie und der Lizenzvereinbarung des Unternehmens.

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