Un nouvel ajout à la boîte à outils de CRISPR : apprendre aux ciseaux à gènes à détecter l'ARN
Des chercheurs présentent la technologie PUMA pour la détection précise de l'ARN avec les nucléases Cas12 qui coupent l'ADN
Les systèmes CRISPR-Cas, systèmes de défense des bactéries, sont devenus une source abondante de technologies pour le diagnostic moléculaire. Des chercheurs de l'Institut Helmholtz de recherche sur les infections à base d'ARN (HIRI) de Würzburg ont élargi cette vaste boîte à outils. Leur nouvelle méthode, appelée PUMA, permet de détecter l'ARN à l'aide des nucléases Cas12, qui ciblent naturellement l'ADN. PUMA promet un large éventail d'applications et une grande précision. L'équipe a publié ses résultats dans la revue Nature Communications.
Les bactéries ont développé des mécanismes de défense spéciaux pour se protéger contre les virus, qui ne sont pas les seuls à infecter l'homme. Dans le cadre de ces systèmes dits CRISPR-Cas, un acide ribonucléique CRISPR (ARNc), qui sert d'"ARN guide", reconnaît des régions d'un génome étranger, comme l'ADN viral. La nucléase associée à CRISPR (Cas), dirigée par un ARNc, le rend alors inoffensif en le coupant comme une paire de ciseaux. L'homme a exploité cette stratégie : CRISPR, souvent appelé "ciseaux à gènes", est à la base de nombreuses technologies moléculaires", explique Chase Beisel, directeur du département de biologie synthétique de l'ARN à l'Institut Helmholtz de recherche sur les infections à base d'ARN (HIRI) de Würzburg. L'institut est un site du Centre Helmholtz de Braunschweig pour la recherche sur les infections (HZI) en coopération avec l'université Julius-Maximilians (JMU) de Würzburg, où M. Beisel est professeur.
La plateforme de diagnostic LEOPARD, développée par le laboratoire de M. Beisel en coopération avec la JMU en 2021, s'appuie également sur la technologie CRISPR. LEOPARD a le potentiel de détecter une variété de biomarqueurs liés à la maladie en un seul test. L'approche est basée sur la reprogrammation de facteurs ARN, appelés tracrRNA. Ces ARN sont naturellement impliqués dans la production d'ARN guides utilisés par Cas9 et différentes nucléases Cas12. "LEOPARD s'est concentré sur Cas9. Cependant, les systèmes CRISPR-Cas comprennent également un autre ensemble diversifié de nucléases, appelé Cas12", explique M. Beisel. Bien que Cas9 et Cas12 coupent toutes deux les cibles d'ADN, Cas12 peut augmenter le signal de sortie en coupant l'ADN "collatéral". Cela peut rendre les technologies de détection plus sensibles et donc plus efficaces.
L'équipe dirigée par Chase Beisel a maintenant étendu les caractéristiques uniques de LEOPARD à Cas12. Les chercheurs ont baptisé la méthode obtenue PUMA(ProgrammabletracrRNAs Unlockprotospacer-adjacent Motif-independentdetection of ribonucleic Acidsby Cas12 nucleases). Les détails de leurs découvertes font l'objet d'un article dans la revue Nature Communications.
Surmonter les obstacles
Bien que les nucléases Cas12 soient largement utilisées dans les diagnostics moléculaires, deux limitations majeures persistent : Les technologies basées sur Cas12 ont été limitées aux cibles d'ADN, et une séquence de reconnaissance spécifique appelée PAM, abréviationde protospacer-adjacent motif, est nécessaire pour identifier la molécule cible.
PUMA relève élégamment ces défis. Comme LEOPARD, cette nouvelle méthode s'appuie également sur les tracrRNA. "En utilisant PUMA, nous pouvons reprogrammer les tracrRNA. Cela nous permet de décider quel biomarqueur ARN devient un ARN guide. Cet ARN guide, à son tour, dirige Cas12 vers une molécule d'ADN que nous fournissons et active les ciseaux génétiques", explique le premier auteur de l'étude, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, ancien étudiant diplômé et chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Beisel, a également participé au développement de LEOPARD. Il est depuis peu professeur à l'université nationale de Singapour. "Le découpage de l'ADN nous indique ensuite quel biomarqueur était présent dans l'échantillon, comme les biomarqueurs spécifiques à différents agents pathogènes", ajoute M. Beisel.
Cette nouvelle méthode permet donc de détecter des biomarqueurs ARN à l'aide des nucléases CRISPR qui ne peuvent normalement reconnaître que l'ADN. "Ceci est particulièrement important pour les biomarqueurs moléculaires qui ne peuvent être trouvés qu'au niveau de l'ARN. Cela inclut les virus à ARN, par exemple", explique M. Beisel. Pourtant, PUMA n'a pas besoin d'une séquence de reconnaissance spécifique : La PAM est contenue dans la molécule cible d'ADN fournie. Comme les chercheurs fournissent la molécule cible, ils peuvent également introduire de l'ADN tronqué. Ils ont ainsi pu augmenter considérablement la vitesse de la méthode.
Plusieurs oiseaux, une seule pierre
"PUMA a le potentiel pour devenir un outil flexible et précis pour la détection de l'ARN", conclut Beisel. Enfin, l'équipe a démontré le potentiel de la méthode en identifiant cinq pathogènes bactériens associés à la septicémie aiguë. Leur détection repose sur un seul tracrRNA universel et reprogrammé, qui offre un moyen simplifié de différencier les divers types de bactéries. Cela ouvre la voie à un large éventail d'applications potentielles en médecine : "La nouvelle technologie représente une nouvelle forme de diagnostic CRISPR qui permet des tests moléculaires fiables sur le lieu de soins, que ce soit pour l'identification d'agents pathogènes viraux ou bactériens ou pour la détection de biomarqueurs du cancer", explique M. Jiao.
L'équipe de recherche planifie déjà ses prochaines étapes : "Notre objectif est de parvenir à une lecture multiplexée similaire à celle de LEOPARD et d'élargir la gamme d'applications de cette technologie", explique M. Beisel, qui prévoit également une large utilisation dans la communauté des chercheurs : "Nous espérons que notre étude incitera à explorer davantage la reprogrammation par tracrRNA."
Note: Cet article a été traduit à l'aide d'un système informatique sans intervention humaine. LUMITOS propose ces traductions automatiques pour présenter un plus large éventail d'actualités. Comme cet article a été traduit avec traduction automatique, il est possible qu'il contienne des erreurs de vocabulaire, de syntaxe ou de grammaire. L'article original dans Anglais peut être trouvé ici.
Publication originale
Chunlei Jiao, Natalia L. Peeck, Jiaqi Yu, Mohammad Ghaem Maghami, Sarah Kono, Daphne Collias, Sandra L. Martinez Diaz, Rachael Larose, Chase L. Beisel; "TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases"; Nature Communications, Volume 15, 2024-7-13
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