Una nueva adición a la caja de herramientas CRISPR: enseñar a las tijeras genéticas a detectar ARN
Investigadores presentan la tecnología PUMA para la detección precisa de ARN con nucleasas Cas12 que cortan el ADN
Los sistemas CRISPR-Cas, sistemas de defensa de las bacterias, se han convertido en una abundante fuente de tecnologías para el diagnóstico molecular. Investigadores del Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en el ARN (HIRI) de Würzburg han ampliado esta extensa caja de herramientas. Su novedoso método, denominado PUMA, permite detectar ARN con nucleasas Cas12, cuyo objetivo natural es el ADN. PUMA promete una amplia gama de aplicaciones y una gran precisión. El equipo publica sus resultados en la revista Nature Communications.
Las bacterias han desarrollado mecanismos de defensa especiales para protegerse de los virus, que en ningún caso infectan sólo a los humanos. Como parte de estos sistemas denominados CRISPR-Cas, un ácido ribonucleico CRISPR (ARNcr), que sirve de "ARN guía", reconoce regiones de un genoma extraño, como el ADN viral. A continuación, la nucleasa asociada a CRISPR (Cas), dirigida por un ARNcr, lo vuelve inofensivo cortándolo como unas tijeras. Los humanos han explotado esta estrategia: "CRISPR, a menudo denominada 'tijera de genes', es la base de muchas tecnologías moleculares", afirma Chase Beisel, jefe del departamento de Biología Sintética del ARN del Instituto Helmholtz de Investigación de Infecciones Basadas en el ARN (HIRI) de Würzburg. El instituto es una sede del Centro Helmholtz de Braunschweig para la Investigación de Infecciones (HZI) en cooperación con la Julius-Maximilians-Universität (JMU) de Würzburg, donde Beisel es catedrático.
La plataforma de diagnóstico LEOPARD, desarrollada por el laboratorio de Beisel en cooperación con la JMU en 2021, también aprovecha la tecnología CRISPR. LEOPARD tiene el potencial de detectar una variedad de biomarcadores relacionados con enfermedades en una sola prueba. El método se basa en la reprogramación de factores de ARN, los denominados tracrARN. Estos ARN participan de forma natural en la producción de los ARN guía utilizados por Cas9 y otras nucleasas Cas12. "LEOPARD" se centró en Cas9. Sin embargo, los sistemas CRISPR-Cas también incluyen otro conjunto diverso de nucleasas, llamadas Cas12", explica Beisel. Aunque tanto Cas9 como Cas12 cortan objetivos de ADN, Cas12 puede aumentar la señal de salida realizando cortes en ADN "colateral". Esto puede hacer que las tecnologías de detección sean más sensibles y, por tanto, más eficaces.
El equipo dirigido por Chase Beisel ha ampliado las características únicas de LEOPARD a Cas12. Los investigadores han bautizado el método resultante como PUMA(ProgrammabletracrRNAs Unlockprotospacer-adjacent Motif-independentdetection of ribonucleic Acidsby Cas12 nucleases). Los detalles de sus hallazgos se publican en la revista Nature Communications.
Superar los obstáculos
Aunque las nucleasas Cas12 se utilizan ampliamente en el diagnóstico molecular, persisten dos grandes limitaciones: Las tecnologías basadas en Cas12 se han restringido a dianas de ADN, y para identificar la molécula diana se requiere una secuencia de reconocimiento específica denominada PAM, abreviaturade motivo adyacente al protoespaciador.
PUMA resuelve con elegancia estos problemas. Al igual que LEOPARD, este nuevo método también se basa en tracrRNAs. "Utilizando PUMA, podemos reprogramar los tracrRNAs. Esto nos permite decidir qué ARN biomarcador se convierte en un ARN guía. Este ARN guía, a su vez, dirige a Cas12 a una molécula de ADN que le proporcionamos y activa las tijeras genéticas", explica el primer autor del estudio, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, antiguo estudiante de posgrado e investigador posdoctoral en el laboratorio de Beisel, también participó en el desarrollo de LEOPARD. Recientemente ha empezado a trabajar como profesor en la Universidad Nacional de Singapur. "El corte del ADN nos indica entonces qué biomarcador estaba presente en la muestra, como los biomarcadores específicos de distintos patógenos", añade Beisel.
El novedoso método permite, por tanto, detectar biomarcadores de ARN utilizando nucleasas CRISPR que normalmente sólo pueden reconocer ADN. "Esto es especialmente importante para los biomarcadores moleculares que sólo pueden encontrarse a nivel de ARN. Esto incluye, por ejemplo, los virus de ARN", explica Beisel. Y sin embargo, PUMA no requiere una secuencia de reconocimiento específica: La PUMA está contenida en la molécula diana de ADN proporcionada. Como los investigadores proporcionan la molécula diana, también pueden introducir ADN truncado. Como resultado, pudieron aumentar significativamente la velocidad del método.
Varios pájaros de un tiro
"PUMA tiene el potencial de convertirse en una herramienta flexible y precisa para la detección de ARN", concluye Beisel. Por último, el equipo demostró el potencial del método identificando cinco patógenos bacterianos asociados a la sepsis aguda. Su detección se basó en un único tracrRNA universal reprogramado, que proporciona un medio simplificado de diferenciar entre varios tipos de bacterias. Esto abre una amplia gama de aplicaciones potenciales en medicina: "La nueva tecnología representa una forma novedosa de diagnóstico CRISPR que permite realizar pruebas moleculares fiables en el punto de atención, ya sea para la identificación de patógenos víricos o bacterianos o para la detección de biomarcadores del cáncer", afirma Jiao.
El equipo de investigación ya está planeando sus próximos pasos: "Nuestro objetivo es lograr una lectura multiplexada similar a la de LEOPARD y ampliar la gama de aplicaciones de la tecnología", afirma Beisel, que también prevé un amplio uso en la comunidad investigadora: "Esperamos que nuestro estudio estimule una mayor exploración de la reprogramación con tracrRNA".
Nota: Este artículo ha sido traducido utilizando un sistema informático sin intervención humana. LUMITOS ofrece estas traducciones automáticas para presentar una gama más amplia de noticias de actualidad. Como este artículo ha sido traducido con traducción automática, es posible que contenga errores de vocabulario, sintaxis o gramática. El artículo original en Inglés se puede encontrar aquí.
Publicación original
Chunlei Jiao, Natalia L. Peeck, Jiaqi Yu, Mohammad Ghaem Maghami, Sarah Kono, Daphne Collias, Sandra L. Martinez Diaz, Rachael Larose, Chase L. Beisel; "TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases"; Nature Communications, Volume 15, 2024-7-13
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