Un nuevo método de microscopía permite el seguimiento en 3D de 100 moléculas individuales a la vez
Tecnología polivalente
Desde su invención hace más de 400 años, el microscopio no ha dejado de evolucionar, profundizando cada vez más en los misterios de la naturaleza a las escalas más pequeñas.
El gráfico muestra el montaje experimental básico de la microscopía de resonancia de plasmón superficial (SPRM). Cuando una partícula de interés se une a un receptor, atado a una fina película de oro, el evento perturba una onda de plasmón superficial, que se registra como un cambio en la intensidad de la luz. La fuente de luz es el SLED (diodo emisor superluminiscente), que ilumina la muestra e induce una onda de plasmón superficial que ondula por la superficie del oro. Una cámara de alta velocidad capta estos rápidos cambios, obteniendo imágenes de la dinámica de unión.
Adapted with permission from Three-Dimensional Tracking of Tethered Particles for Probing Nanometer-Scale Single-Molecule Dynamics Using a Plasmonic Microscope Copyright 2021 American Chemical Society.
En una nueva investigación, el profesor Shaopeng Wang, su investigador postdoctoral Guangzhong Ma y sus colegas del Centro de Bioelectrónica y Biosensores de la Universidad Estatal de Arizona describen los avances en microscopía basados en un fenómeno conocido como resonancia de plasmón superficial (SPR).
El nuevo estudio destaca una serie de experimentos que muestran cómo la tecnología SPR puede utilizarse para obtener imágenes precisas de 100 moléculas individuales simultáneamente y describir sus actividades dinámicas en tiempo real, en particular cuando las moléculas se unen entre sí y llevan a cabo importantes funciones biológicas.
"Aprovechando la altísima sensibilidad en la dirección axial (vertical), la SPR puede rastrear los movimientos axiales de las partículas con una precisión subnanométrica, lo que es mucho más preciso que las imágenes de microscopía habituales", afirma Wang. "Demostramos que esta característica puede utilizarse para estudiar los detalles de los eventos de unión molecular a nivel de una sola molécula y también para procesar múltiples señales a la vez".
Ciencia de nueva ola
La SPR es un efecto óptico que puede utilizarse para detectar y medir con precisión la unión de moléculas sin necesidad de etiquetas fluorescentes. La técnica tiene amplias aplicaciones, tanto en la industria como en el campo de la medicina, donde puede utilizarse para cribado y desarrollo de nuevos fármacos y bioterapias, nuevos ensayos de diagnóstico y desvelar algunos de los mecanismos de las enfermedades.
Muchas biomoléculas fundamentales para la salud y la enfermedad son difíciles de observar mediante técnicas convencionales como la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN. La SPR ofrece una alternativa eficaz y de bajo coste para estas investigaciones.
La SPR se basa en el hecho de que los metales contienen muchos electrones que no están unidos a los átomos. Cuando la luz incidente incide sobre estos electrones libres en las condiciones adecuadas, la energía contenida en la luz hace que estos electrones resuenen, produciendo una onda a través de la superficie del metal, conocida como plasmón superficial.
La técnica SPR puede utilizarse para medir la unión entre proteínas, ácidos nucleicos, pequeñas moléculas y muchas otras interacciones. Las exploraciones precisas de estas biomoléculas son un reto, ya que la mayoría miden sólo unos pocos nanómetros de tamaño. Los datos resultantes pueden ayudar a los investigadores a identificar qué moléculas de una muestra interactúan, por qué interactúan y la fuerza de estas interacciones.
La SPR es una de las únicas técnicas que permite a los investigadores estudiar no sólo la afinidad de unión de las moléculas, sino también su cinética de unión, lo que proporciona una valiosa información que no se capta con las pruebas tradicionales, como el ELISA. La Microscopía de Resonancia de Plasmón de Superficie (SPRM) lleva el fenómeno básico de la SPR un paso más allá, produciendo una tecnología altamente versátil para investigar los eventos de unión molecular a escalas sub-nanométricas y con una resolución temporal de milisegundos.
Detecciones sensibles
Para utilizar la SPR para sondear delicadamente la unión de una sola molécula, la molécula receptora, como un segmento corto de ADN, se inmoviliza en una superficie de sensor compuesta por una capa muy fina de oro. A continuación, se añade la molécula de unión a una solución acuosa.
Cuando la luz polarizada se dirige a la película de oro con el ángulo adecuado, se generan ondas plasmónicas. Se puede detectar un evento de unión del receptor inmovilizado y la molécula de unión cuando altera el índice de refracción en la superficie del oro. Este efecto actúa para perturbar el plasmón de la superficie, produciendo un aumento de la intensidad de la señal. Estos efectos fugaces se captan entonces con la ayuda de cámaras de alta velocidad.
En el presente estudio, se utilizó la imagen SPR para rastrear 100 partículas simultáneamente en tres dimensiones. En uno de los experimentos, segmentos unidos de ADN de doble cadena, de 48 pares de bases de longitud y fijados a una superficie de oro, actuaron como moléculas receptoras. La molécula que pretendían detectar era una pequeña enzima conocida como helicasa. Su función en los sistemas biológicos es unirse al ADN y desenrollarlo, cuando es necesario reparar la secuencia del mismo.
La helicasa de ADN se unió primero a una nanopartícula de oro para que la SPR revelara sus sutiles propiedades ópticas al unirse a la cadena de ADN.
Al añadir ATP a la solución acuosa, la helicasa se puso manos a la obra, desenrollando la doble cadena de ADN a un ritmo de unos 10 pares de bases por segundo, y la acción en directo fue captada por una cámara de 400 fps. El método de seguimiento en 3D de alta precisión descrito en el estudio permitió a los investigadores obtener la velocidad de desenrollado de la cadena de ADN y el ángulo de rotación de la molécula de helicasa unida.
Tecnología polivalente
Otros experimentos demuestran que el método puede llevar a cabo una detección basada en partículas de la unión de anticuerpos a antígenos y discriminar entre eventos de unión específicos y no específicos. (La unión no específica de anticuerpos puede producirse cuando una célula carece de un receptor o epítopo para un anticuerpo específico). En este caso, se observó la molécula troponina T, un biomarcador común de las enfermedades cardíacas, cuando se unió a su correspondiente anticuerpo fijado a la superficie de oro.
La capacidad de separar los eventos de unión específicos de los no específicos es una ventaja valiosa, ya que estos últimos a menudo se producen en muestras mixtas como el suero, lo que dificulta un análisis de diagnóstico preciso.
Además, dado que la técnica SPRM puede capturar datos de 100 moléculas a la vez en 3 dimensiones, el método permite un análisis estadístico detallado de los eventos de unión molecular y la cinética que no es posible con los métodos convencionales. Así pues, la nueva técnica resulta muy prometedora para la detección rápida, económica y detallada de biomoléculas, y podría incorporarse a una nueva generación de dispositivos de biodetección.
Nota: Este artículo ha sido traducido utilizando un sistema informático sin intervención humana. LUMITOS ofrece estas traducciones automáticas para presentar una gama más amplia de noticias de actualidad. Como este artículo ha sido traducido con traducción automática, es posible que contenga errores de vocabulario, sintaxis o gramática. El artículo original en Inglés se puede encontrar aquí.
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