Gentests mit dem bloßen Auge

Replikation von Enzym-Nukleotid-Hybriden

14.07.2016 - Deutschland

DNA-Polymerasen sind die „molekularen Kopiermaschinen“, die unsere DNA vervielfältigen. Damit sich keine Fehler ins Erbgut einschleichen, müssen sie sehr genau arbeiten. Trotzdem akzeptieren sie Bausteine, an die große Proteine gekoppelt wurden, wie deutsche Wissenschaftler in der Zeitschrift Angewandte Chemie berichten. Darauf basierend entwickelten sie mit bloßem Auge auswertbare Detektionssysteme für die Genotypisierung von DNA und RNA, die Wege zu einer neuen Vor-Ort-Diagnostik eröffnen könnten.

DNA-Polymerasen lesen einen DNA-Einzelstrang ab und bauen das komplementäre Gegenstück Nukleotid für Nukleotid zusammen. Obwohl sie die Form des einzubauenden Nukleotids „erkennen“ müssen, akzeptieren Polymerasen auch leicht veränderte Nukleotide. Dies wird in der Biotechnologie genutzt, um z.B. Markierungen anzubringen. Das Team um Andreas Marx von der Universität Konstanz konnte jetzt zeigen, dass hochselektiv arbeitende DNA-Polymerasen aber auch Nukleotide in einen DNA-Strang einbauen, die mit großen Proteinen wie Meerrettich-Peroxidase verknüpft sind – obwohl diese „Fracht“ mehr als hundertmal größer ist als das Nukleotid selbst. Einzige Voraussetzung: Ein Verbindungsstück zwischen Protein und Nukleotid muss einen Mindestabstand sicherstellen.

Diese erstaunliche Erkenntnis haben die Forscher ausgenutzt, um Detektionssysteme zu entwickeln, die die Anwesenheit einer spezifischen DNA oder RNA mit bloßem Auge erkennbar anzeigen. Auf diese Weise könnten beispielsweise Genabschnitte nachgewiesen werden, die mit Erbkrankheiten oder Krebserkrankungen in Zusammenhang stehen.

Für einen solchen Test wird ein sogenannter Primer, ein kurzes DNA-Segment, das komplementär zu der gesuchten Sequenz ist, auf einem Träger fixiert. Ist in der dann zugegebenen Probe der gesuchte DNA-Abschnitt vorhanden, bindet der entsprechende Einzelstrang (in diesem Zusammenhang als Templat bezeichnet) an den Primer. Bereits eine einzige falsche Base verhindert diese Anbindung. Anschießend werden eine DNA-Polymerase und Hybride aus Nukleotid und Meerrettich-Peroxidase zugegeben. Ist ein Templat am Primer gebunden, wird die Polymerase aktiv und kuppelt das passend ausgewählte Nukleotid-Hybrid an. Ungebundenes Hybrid wird durch Waschen entfernt und dann ein farbloses Reagenz zugegeben, das von der Meerrettich-Peroxidase zu einem rot-bräunlichen Farbstoff umgesetzt wird. Mit bloßem Auge lässt sich anhand der Färbung die Konzentration des gesuchten DNA-Abschnitts mit dem bloßen Auge abschätzen. Kolorimetrisch ließ sich noch 1 fmol nachweisen.

Auch eine ganz gezielte Suche nach definierten Punktmutationen gelingt. Der Primer muss dazu direkt vor der relevanten Stelle enden. Das Templat bindet dann zwar, aber das Nukleotid-Enzym-Hybrid wird nur angekuppelt, wenn das Templat an dieser Stelle die gesuchte Base aufweist.

Mit einer anderen Polymerase gelang den Forschern außerdem der Nachweis spezifischer bakterieller RNA; ein Ansatz, der für die Identifikation von Pathogenen sehr interessant ist.

Da die verwendeten Polymerasen bei Raumtemperatur arbeiten, kann auf aufwändige Laborausstattungen wie Thermocycler verzichtet werden. Einsätze direkt beim Patienten oder an abgelegenen Orten sind daher möglich.

Originalveröffentlichung

Moritz Welter, Daniela Verga, Andreas Marx; "Sequenz-spezifischer Einbau von Enzym-Nukleotid-Chimären durch DNA-Polymerasen"; Angewandte Chemie; 8 July 2016

https://www.bionity.com/de/news/158922/gentests-mit-dem-blossen-auge.html

Originalveröffentlichung

Moritz Welter, Daniela Verga, Andreas Marx; "Sequenz-spezifischer Einbau von Enzym-Nukleotid-Chimären durch DNA-Polymerasen"; Angewandte Chemie; 8 July 2016

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