STED-Mikroskop

Ein STED-Mikroskop (Stimulated Emission Depletion) ist ein von Stefan Hell am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen entwickeltes Mikroskop, das auf dem Prinzip des konfokalen Laser-Scanning basiert.

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Während die beugungsbegrenzte Auflösung für gewöhnliche optische Fernfeldmikroskope bei ca. 200 nm liegt, lassen sich mit dem STED-Verfahren Strukturen mit einer Größe abbilden, die unterhalb der Abbeschen Beugungsgrenze liegt. Ein STED-Mikroskop erreicht praktisch sowohl lateral als auch axial eine Auflösung weit unter 100 nm.

Funktionsprinzip

Mit einem kleinen Lichtstrahl werden Farbstoffe angeregt (An, rot im Bild) und mit einem weiteren Lichtstrahl wieder 'gequencht' (Aus, blau im Bild). Beide Lichtstrahlen sind nach den Gesetzen der Optik nicht schärfer zu fokussieren als das Abbe-Gesetz. Da aber der "Ausmach"-Strahl nur an einer sehr kleinen Stelle (in der Mitte) Null ist, bleibt auch nur an einer sehr kleinen Stelle leuchtender Farbstoff übrig (schwarz im Bild).

Hauptproblem dabei ist der "Ausmach"-Vorgang. Hier kommt bei STED die stimulierte Emission zum Einsatz.

Das STED-Mikroskop basiert grundsätzlich auf dem Phänomen der Fluoreszenz. Ein bedeutendes Problem gleich welcher lichtmikroskopischen Technik ist der mangelnde Kontrast von Zellbestandteilen. Schon lange benutzt man deshalb fluoreszente Moleküle, die z.B. mit gentechnischen Methoden oder mittels Antikörpern selektiv an bestimmte Moleküle einer Zelle geheftet werden können. Man kann zum Beispiel Farbstoffe nur an Mitochondrien anbauen. Beleuchtet man nun eine Stelle der so präparierte Zelle mit einem fokussierten Laserstrahl und erhält man von dort Fluoreszenz, so waren an genau dieser Stelle Farbstoffmoleküle und damit auch Mitochondrien. Um ein vollständiges Bild zu erhalten, wird die Probe Punkt für Punkt abgescannt.

Das Problem war bis jetzt, dass der Anregungstrahl aufgrund der Abbeschen Beugungsgrenze nicht beliebig klein fokussiert werden kann. Man regt also immer alle Moleküle, die sich gerade im Brennfleck befinden an und kann daher nicht entscheiden, von welchem Molekül die Fluoreszenz gerade kommt. Somit können Strukturen, die kleiner sind als die Ausdehnung des Laserfokus nicht unterschieden werden.

Der Trick hinter STED ist nun folgender: Zunächst wird, genau wie bei der konventionellen Mikroskopie, eine minimal 200nm (Durchmesser) kleine Fläche mittels eines fokussierten Lichtstrahls angeregt. Ein zweiter Lichtstrahl niedrigerer Energie wird wenige Picosekunden hinter dem Anregungsstrahl hergeschickt bevor die angeregten Farbstoffmoleküle von sich aus fluoreszieren können. Wo dieser Strahl auf einen angeregten Fluoreszenzmarker trifft, regt er diesen wieder ab. Indem der zweite Strahl ringförmig um die vorher angeregte Stelle gelegt wird, kann ein Großteil der angeregten Fläche (die Ränder) wieder abgeregt werden bevor es zur spontanen Emission von Fluoreszenz kommt. Somit lässt sich die emittierende Fläche - also das Zentrum des Rings - effektiv verkleinern. Die Detektion von Fluoreszenz erfasst dann nur diejenigen Markermoleküle, die nicht abgeregt wurden. Das kann theoretisch nur ein einzelnes Molekül sein, das sich vorher in der Mitte des Anregungsflecks befand. Die Ortsauflösung des optischen Detektors ist dabei gleichgültig.

In einem STED-Mikroskop lassen sich alle Präparate untersuchen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierbar sind. Anders als bei Elektronenmikroskopen sind kein Vakuum und keine dünnen Schnitte erforderlich, da es sich um eine Fernfeld-Technik handelt. Die Proben erleiden keine Strahlenschäden, so dass sich theoretisch auch lebende Zellen beobachten lassen.

Das STED-Mikroskop und die Gruppe um Stefan Hell wurden für Ihre Ergebnisse im Jahr 2006 mit dem Deutschen Zukunftspreis ausgezeichnet.

Ein weiteres von der Arbeitsgruppe um Stefan Hell entwickeltes Mikroskop ist das 4Pi-Mikroskop.

Literatur

• Klar, T. A., S. Jakobs, M. Dyba, A. Egner and S. W. Hell (2000). Fluorescence microscopy with diffraction resolution limit broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210.

• Dyba, M. and S. W. Hell (2002): Focal spots of size lambda/23 open up far-field florescence microscopy at 33 nm axial resolution; Physical Review Letters 88 (16) 163901-1-163901-4.

• Willig, K. I., S. O. Rizzoli, V. Westphal, R. Jahn, S. W. Hell (2006): "STED-microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis". Nature 440 (7086): 935–939.

Web-Links

• Abteilung NanoBiophotonics am MPI für biophysikalische Chemie (englisch)
• Detailinformationen und Bilder zur STED-Mikroskopie (PDF-Datei)
• Hintergrundinformationen - Deutscher Zukunftspreis