Real time quantitative PCR

Die Real-Time-quantitative-PCR (RTQ-PCR, auch Real Time Detection PCR, kurz RTD-PCR) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung bietet. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen am Ende bzw. während eines PCR-Zykluses (daher der Name "Real Time") durchgeführt und unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR quantitativ ausgewertet werden (z.B. Kompetitive PCR). Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu, was eine Quantifizierung möglich macht. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente ist nicht nötig, die Daten sind sofort verfügbar und das Kontaminationsrisiko ist gering.

Die Real-Time-quantitative-PCR kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z.B. zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Zellen.

Für die Real-Time-PCR wird oft die Abkürzung RT-PCR verwendet, was aber auch zu Verwechslungen führen kann, da auch die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion so abgekürzt wird.

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Methoden

Interkalierende Farbstoffe

Die einfachste Möglichkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z.B. Ethidiumbromid oder SYBR^® Green I).

Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in die DNA ein (interkalieren) bzw. binden an die doppelsträngige DNA, wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der Target-DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus.

Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann. Außerdem können keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden.

Der Vorteil ist, dass nach abgelaufener PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden kann, anhand derer die Fragmentlänge(n) und dadurch die Spezifität bestimmt werden kann.

Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50°C -> 95°C). Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur wird der Doppelstrang wieder ein einzelsträngiges Molekül. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR^® Green I) freigesetzt, und es wird eine Fluoreszenzabnahme registriert. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Die Höhe des Peaks der Schmelzkurve gibt annähernd Auskunft über die Menge des gebildeten Fragments.

FRET-Sonden

Eine andere Möglichkeit ist, den Förster resonance energy transfer (FRET) auszunutzen. Ein Donor-Fluorochrom (Reporter), das durch eine Lichtquelle angeregt wird, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Nähe befindliches Akzeptor-Fluorochrom (bzw. einen "dunklen" Quencher) ab. Nimmt der Abstand zwischen Akzeptor und Donor zu, so nimmt FRET und somit das Fluoreszenzsignal des Akzeptors ab, während das des Donors zunimmt. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, bietet aber die Vorteile der hohen Spezifität des Assays.

LightCycler^®-Sonden (auch Hybridisierungs-Sonden)

Die einfachste Möglichkeit der Nutzung des FRET zur Quantifizierung von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von LightCycler^®-Sonden. Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor markierte Oligonukleotide, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen, können als Sonden für die Quantifizierung der PCR-Produkte eingesetzt werden.

TaqMan^®-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden)

Eine weitere häufig genutzte Möglichkeit des FRET besteht in der Anwendung einer Sonde, die an ihrem einen Ende mit dem Quencher, an ihrem anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (z.B. TAMRA und FAM) markiert wird (Double-Dye-Oligos, TaqMan^®-Sonde). Wenn die Taq-Polymerase, die zusätzlich eine Exonuclease-Aktivität besitzt, die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5'-Ende abbaut, entfernen sich dadurch Quencher und Fluorophor voneinander, und eine steigende Reporter-Fluoreszenz kann gemessen werden.

Molecular Beacons

  Eine weitere Möglichkeit der Echtzeit-Quantifizierung von PCR-Produkten unter Ausnutzung des FRET bietet die Nutzung von Molecular Beacons als Sonden. Molecular Beacons sind Oligonucleotide, die sowohl mit einem Reporter-Fluorophor als auch mit einem Quencher gekoppelt sind. Die Nucleotide am 5'-Ende der Sonde sind zu denen am 3'-Ende komplementär, so dass sich eine für Molecular Beacons charakteristische Sekundärstruktur ausbilden kann. In diesem als stem loop (=Stamm-Schleife) bezeichneten Zustand zeigt der Reporter durch seinen geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz. Durch Anlagerung der Schleifen-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz während eines PCR-Zyklus wird der Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert. Eine Reporter-Fluoreszenz kann somit beobachtet werden.

Scorpion-Primer

  Scorpion-Primer sind komplexe Oligonucleotide, welche die Eigenschaften von Real-Time-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem (Uni-Scorpion) oder zwei Molekülen (Bi-Scorpion) vereinigen. Ähnlich den Molecular Beacons besitzen sie eine charakteristische Sekundärstruktur mit einer selbstkomplementären Schaft-Region, deren Enden mit einem Reporter-Fluorophor und einem Quencher modifiziert wurden. Zusätzlich tragen diese Sonden am 3'-Ende einen PCR-Primer. Während eines PCR-Zyklus kann mit steigender DNA-Konzentration eine Reporter-Fluoreszenz durch Anlagerung der Loop-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz und damit vergrößerten Abstand zwischen Quencher und Reporter beobachtet werden.

Lux^®-Primer

Lux^®-Primer sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonucleotide, deren Fluoreszenzintensität von ihrer jeweiligen chemischen Umgebung abhängt. Werden diese Primer während einer PCR in eine DNA eingebaut, kann eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden.

Quantifizierung

Verschiedene Rechenmodelle werden für die Quantifizierung herangezogen, wobei meistens ein Referenz-Gen (z.B. GAPDH, Actin, Tubulin) mitgemessen wird, um einen relativen Menge-Vergleich durchzuführen (relative Quantifizierung). Andere, weitaus kompliziertere Methoden sollen eine absolute Quantifizierung ermöglichen, bei der die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmt werden kann.

CT-Wert oder auch Cp-Wert

In der ersten Phase der Amplifikation einer PCR ist die Templatemenge begrenzt und die Wahrscheinlichkeit, dass sich Template, Primer und Polymerase treffen, suboptimal, während in der dritten Phase der Amplifikation die Menge der Produkte (DNA, Pyrophosphat, Monophosphatnucleotide) derart ansteigt, dass es zur Hemmung durch diese kommt, häufiger Produktfragmente miteinander hybridisieren, die Substrate langsam verbraucht werden und letztlich die Polymerasen und Nucleotide durch die Hitze langsam zerstört werden. Ein exponentieller und daher quantifizierbarer Anstieg findet sich nur in der Phase dazwischen. Exponentiell bleibt eine PCR bei 12 bis 400 Ausgangskopien für ca. 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei anfänglich 3200 bis 51200 für höchstens 20 Zyklen. Um immer am Anfang der exponentiellen Phase messen zu können, wird häufig der CT-Wert (Threshold Cycle = "Schwellenwert-Zyklus") bzw. der Cp-Wert (Crossing Point) verwendet, der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.

Effizienz

Die Effizienz kann auf verschiedene Arten berechnet werden, die sich in ihrem Ergebnis leicht unterscheiden. Die einfachste Art ist folgende:

Die Effizienz E kann mit Hilfe der Steigung m einer Standardkurve berechnet werden:

E = 10 ^{− 1 / m} − 1

Eine Steigung m von -3.32 würde somit eine Effizienz von 100 % bedeuten, d.h. eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus. -3.58 eine Effizienz von 90 %.

Absolute Quantifizierung

Eine absolute Quantifizierung ist aufwändig und die Ergebnisse fragwürdig, daher wird diese Art der Quantifizierung selten durchgeführt. So muss u.a. die Effizienz der reversen Transkription, die zwischen 5 und 95% liegen kann, bestimmt werden, z.B. durch Verwendung synthetisierter RNA bekannter Menge.

Relative Quantifizierung

Hierfür wird eine interne Kontrolle benötigt. Eine interne Kontrolle kann ein Gen-Transkript sein, dessen Signal verwendet wird, um Variationen in der Ausgangsmenge der eingesetzten RNA auszugleichen. Dies wird als Normierung bezeichnet. Weil die Gesamtanalyse auf diesem Signal beruht, ist die Wahl der internen Kontrolle ein wichtiger Aspekt des Experiments. Die ideale interne Kontrolle ist leicht zu detektieren,und deren Expression sollte nicht während des Zellzyklus, zwischen Zelltypen oder als Antwort auf die experimentelle Behandlung (z.B. Stress, Medikamente, Krankheit) variieren.

Berechnung mit Hilfe einer Standard-Kurve

Es besteht eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge und dem CT. Ist die Ausgangsmenge bekannt, kann eine Standardkurve durch Auftragen des Logarithmus der Ausgangsmenge gegen den CT konstruiert werden. Durch die Geradengleichung x = (CT - b)/m kann an der Standardkurve für jede unbekannte Probe der Logarithmus der Kopienzahl bestimmt werden. Alle Proben werden normiert, indem die errechnete Kopienzahl des Targetgens durch die Kopienzahl der internen Referenz geteilt wird: GEN(normiert) = Kopienzahl Target / Kopienzahl Referenz

Die unterschiedliche Expression zweier Proben relativ zueinander lässt sich als Quotient darstellen und ergibt eine n-fache Expression : GEN(normalisiert) (Gruppe A) / GEN(normalisiert) (Gruppe B) = n-Fache Expression Gruppe A zu Gruppe B

Berechnung nach der delta-delta-CT-Methode

Die unterschiedliche Expression wird als n-fache Expression mit Hilfe des delta-delta-CT-Wertes angegeben. Wichtig bei diesem Verfahren ist eine gleiche Effizienz der beiden beteiligten PCR-Reaktionen. Die CT-Werte werden hierbei einfach voneinander abgezogen (delta-CT), die beiden delta-CT-Werte der einzelnen Gruppen (z.B. krank/gesund, mit/ohne Medikament) voneinander abgezogen (delta-delta-CT-Wert) und in die Gleichung n-Fache Expression (Gruppe A zu Gruppe B) = 2 ^{-delta-delta-CT} eingesetzt.

Neue Quantifizierungsalgorithmen

Um die Genauigkeit der relativen Quantifizierung zu verbessern, sind verschiedene, teils auf der delta-delta-CT-Methode basierende Ansätze entwickelt worden.

1. Erweiterung der Formel der delta-delta-CT-Methode um die Effizienz des jeweiligen PCR-Ansatzes, die zuvor in einem Probelauf über eine Standardkurve bestimmt werden muss.

2. Mittels Regressionsanalysen Fit der Real-time-PCR-Datensätze an eine exponentielle Funktion bzw. in linearisierter Form an eine Geradengleichung. Der Schnittpunkt dieser Funktionen mit der y-Achse gibt dann Aufschluss über die ursprünglich im Ansatz vorhandene DNA-Menge (relative Angabe im Vergleich zu einer Referenzprobe).

3. Fit der Real-time-PCR-Daten an eine drei- oder mehrparametrige sigmoide Funktion. Auch hier wird die relative DNA-Menge über y(0) bestimmt.

Vorteile dieser neuen, überwiegend noch nicht marktreifen Methoden liegen in der genaueren Analyse und geringeren Varianz der PCR-Ergebnisse. Bei einigen Methoden wird die Effizienz in jedem einzelnen Probenansatz berücksichtigt und ermöglicht so eine "single tube" Analyse.

Reproduzier- und Vergleichbarkeit der Ergebnisse

Ein Experiment ist gar nichts wert, wenn man es nicht wiederholen kann. Hierfür ist es absolut notwendig die Versuchsbedingungen konstant zu halten. Dabei ist hier nicht nur die Konsistenz der Assay-Qualität (Primer, Sonden, Polymerase, Puffer etc) zu berücksichtigen, auch die Geräte müssen den Anforderungen genügen. Beispielsweise ist bei Block-Systemen (96- oder 384-Wells) die so genannte Homogenität das große Kriterium. Die Assays müssen in jedem Well des Blocks und zudem auf Blöcken baugleicher Geräte gleichgut laufen. Weiterhin darf sich im zeitlichen Verlauf diese Homogenität nicht verändern. Um sicher zu stellen, ob man mit dem Gerät im Labor sichere Experimente durchführen kann, sollte man in regelmäßigen Abständen entsprechende Kontrollen durchführen (einige Modelle neigen extrem zum Altern!). Dabei wird ein Assay in vielen Replikaten über den gesamten Block verteilt analysiert. Ganz klar: das Ergebnis sollte im Idealfall überall gleich sein. Jetzt sollte dem Experimentator bewusst sein, inwieweit Abweichungen auch relevante Auswirkungen haben können. Diese Abweichungen lassen sich übrigens nicht mittels teurer Wiederholungen ausgleichen, da dieser ebenso konstant wiederholt werden würde.

www.gene-quantification.info englische Seite mit allem Wissen, Tips und Tricks über qPCR

Real Time PCR Tutorial

[1] deutsches Paper über Real-time-PCR von der TU München

realtimepcr.dk Real time PCR (Kopenhagen)