RACE-PCR

Die „rapid amplification of cDNA-ends“ durch „polymerase chain reaction“ - kurz RACE-PCR - bedeutet in etwa „Schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden durch Polymerase-Kettenreaktion“. Der sprechbare Abkürzungsteil „RACE“ (=Rennen) ist eine Anspielung auf die Geschwindigkeit der Methode.

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Das Ziel von RACE-PCRs liegt in der Isolation von Gen-Enden und ist eine Abwandlung der RT-PCR.

Methoden

Je nachdem, welches Genende man untersuchen will, macht man eine 5'-RACE oder eine 3'-RACE. Die 3'-RACE ist die einfachere Methode, da man den Startpunkt durch den poly(A)-Schwanz schon hat. Nachteil ist, dass man vor allem den nichtkodierenden 3'UTR erwischt, da dieser durchschnittlich 770bp lang ist, und die Taq-Polymerase ab circa 800-1000bp dazu neigt mit der DNA-Polymerisierung aufzuhören. Moderne (und teurere) Polymerasen schaffen aber auch mehr.
Der 5'UTR ist im Durchschnitt kürzer (etwa 300bp) und bietet zusätzlich für die Untersuchung der Genregulation interessante Stellen.

Bei der 3'-RACE beginnt man mit einem oligo(dT), an dem am 5'-Ende ein von der Sequenz bekannter „Anker-Primer“ angehangen ist. Die oligo(dT)-Sequenz lagert sich an den poly(A)-Schwanz und dient als Primer für die Reverse Transkription. Danach wird die mRNA durch RNaseH degradiert und ein zweiter Primer (in sense-Richtung), der im Geninneren liegt, an den neu entstandenen cDNA-Strang angelagert. Danach wird eine normale PCR mit dem internen sense-Primer und dem Ankerprimer gemacht.

Bei der 5'-RACE muss man mit einem internen Primer, der in Gegensinn-Richtung (antisense) gerichtet ist beginnen. Mit diesem wird mit der Reversen Transkriptase der cDNA-Gegenstrang zur mRNA synthetisiert bis zum 5'-Ende der mRNA. Daraufhin wird mit einer terminalen Nukleotidyltransferase und dATP ein eigenes "poly(A)-Ende" hergestellt. Danach wird die mRNA durch RNaseH degradiert. An diesen cDNA-poly(dA)-Schwanz wird nun ein Ankerprimer (ein oligo(dT) mit einem bekannten Primer) angelagert. Daraufhin wird eine normale PCR mit dem internen antisense-Primer und dem Ankerprimer gemacht.

Bei der sogenannten Capfinder-Strategie der RACE (auch RLM-RACE) lagert man den 5'-Primer schon an die mRNA an und lässt den Anker raus. Dazu werden vorher sämtliche freien 5'-OH-Enden durch das Enzym calf intestine phosphatase (CIP) degradiert, nur durch capping geschützte mRNAs bleiben übrig. Danach werden die caps mit Hilfe einer Nikotinsäure-Pyrophosphatase (tobacco acid pyrophoshatase oder TAP) abgespalten (das 5'-α-Phosphat bleibt aber übrig). Mit einer T4-DNA-Ligase wird dann ein Adapter mit bekannter Sequenz angelagert. Es folgt eine Reverse Transkription und die normale PCR mit dem RT-Primer und dem Adapter-Primer am 5'-Ende.

Bei der SMART-RACE (switching mechanism at 5' end of RNA transcript) wird die gesamte mRNA von einem oligo(dT)-Primer aus in cDNA umgeschrieben. An das 3'-Ende der cDNA (entspricht dem 5'-Ende der mRNA) wird ein oligo(dC) (3-5 Cytosinnukleotide) angefügt. Mit Hilfe eines Ankerprimers mit einem passenden oligo(dG) und einem oligo(dA)-Ankerprimer für das 3'-Ende wird dann eine PCR durchgeführt.

Siehe auch

• RT-PCR

Literatur

• Frohman, M. A. (1993): Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol 218: 340-356