Um alle Funktionen dieser Seite zu nutzen, aktivieren Sie bitte die Cookies in Ihrem Browser.
my.bionity.com
Mit einem my.bionity.com-Account haben Sie immer alles im Überblick - und können sich Ihre eigene Website und Ihren individuellen Newsletter konfigurieren.
- Meine Merkliste
- Meine gespeicherte Suche
- Meine gespeicherten Themen
- Meine Newsletter
RACE-PCRDie „rapid amplification of cDNA-ends“ durch „polymerase chain reaction“ - kurz RACE-PCR - bedeutet in etwa „Schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden durch Polymerase-Kettenreaktion“. Der sprechbare Abkürzungsteil „RACE“ (=Rennen) ist eine Anspielung auf die Geschwindigkeit der Methode. Weiteres empfehlenswertes FachwissenDas Ziel von RACE-PCRs liegt in der Isolation von Gen-Enden und ist eine Abwandlung der RT-PCR. MethodenJe nachdem, welches Genende man untersuchen will, macht man eine 5'-RACE oder eine 3'-RACE. Die 3'-RACE ist die einfachere Methode, da man den Startpunkt durch den poly(A)-Schwanz schon hat. Nachteil ist, dass man vor allem den nichtkodierenden 3'UTR erwischt, da dieser durchschnittlich 770bp lang ist, und die Taq-Polymerase ab circa 800-1000bp dazu neigt mit der DNA-Polymerisierung aufzuhören. Moderne (und teurere) Polymerasen schaffen aber auch mehr. Bei der 3'-RACE beginnt man mit einem oligo(dT), an dem am 5'-Ende ein von der Sequenz bekannter „Anker-Primer“ angehangen ist. Die oligo(dT)-Sequenz lagert sich an den poly(A)-Schwanz und dient als Primer für die Reverse Transkription. Danach wird die mRNA durch RNaseH degradiert und ein zweiter Primer (in sense-Richtung), der im Geninneren liegt, an den neu entstandenen cDNA-Strang angelagert. Danach wird eine normale PCR mit dem internen sense-Primer und dem Ankerprimer gemacht. Bei der 5'-RACE muss man mit einem internen Primer, der in Gegensinn-Richtung (antisense) gerichtet ist beginnen. Mit diesem wird mit der Reversen Transkriptase der cDNA-Gegenstrang zur mRNA synthetisiert bis zum 5'-Ende der mRNA. Daraufhin wird mit einer terminalen Nukleotidyltransferase und dATP ein eigenes "poly(A)-Ende" hergestellt. Danach wird die mRNA durch RNaseH degradiert. An diesen cDNA-poly(dA)-Schwanz wird nun ein Ankerprimer (ein oligo(dT) mit einem bekannten Primer) angelagert. Daraufhin wird eine normale PCR mit dem internen antisense-Primer und dem Ankerprimer gemacht.
Bei der SMART-RACE (switching mechanism at 5' end of RNA transcript) wird die gesamte mRNA von einem oligo(dT)-Primer aus in cDNA umgeschrieben. An das 3'-Ende der cDNA (entspricht dem 5'-Ende der mRNA) wird ein oligo(dC) (3-5 Cytosinnukleotide) angefügt. Mit Hilfe eines Ankerprimers mit einem passenden oligo(dG) und einem oligo(dA)-Ankerprimer für das 3'-Ende wird dann eine PCR durchgeführt. Siehe auchLiteratur
|
Dieser Artikel basiert auf dem Artikel RACE-PCR aus der freien Enzyklopädie Wikipedia und steht unter der GNU-Lizenz für freie Dokumentation. In der Wikipedia ist eine Liste der Autoren verfügbar. |