ONPG-Test

Die Hydrolyse des synthetischen Substrates O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) der β-Galactosidase wird in der mikrobiologischen Diagnostik eingesetzt um Bakterienarten, z.B. aus der Gruppe der Burkholderia spezies, anhand ihrer β-Galactosidase-Expression voneinander zu unterscheiden.

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Naturwissenschaftliche Grundlagen

Einige Bakterienarten besitzen das Enzym β-Galactosidase, das es ihnen ermöglicht den Zweifachzucker Laktose zu verstoffwechseln. Beim ONPG-Test ersetzt das synthetische Galactosid O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid das natürliche Substrat der β-Galactosidase – Allolaktose. Es wird wie Laktose durch die Galactosid-Permease in die Zelle hineingebracht und durch die β-Galactosidase hydrolysiert. Hierbei entstehen die beiden Reaktionsprodukte Galaktose und o-Nitrophenol. Letzteres verursacht eine gelbe Verfärbung des Ansatzes bei positivem Testergebnis.

Testdurchführung

Für jede Probe legt man in ein steriles Röhrchen je eine ONPG-Scheibe und gibt etwa 200 µl der sterilen Kochsalzlösung hinzu, so daß sich die ONPG-Scheibe vollständig unter der sterilen Kochsalzlösung befindet. Anschließend werden etwa 1 bis 3 Kolonien des zu untersuchenden Bakteriums von einem festen Nährmedium (Agarplatte/Primärkultur) mit Hilfe eines sterilen Stabes in der sterilen Kochsalzlösung suspendiert. Das Röhrchen mit dem Ansatz bebrütet man dann bei 36 +/-1 °C für maximal 24 Stunden und beobachtet ob sich eine Farbveränderung der Suspension einstellt.

Auswertung des Tests

Die Ablesung des Testes erfolgt nach etwa 1, 6 und ggf. 24 Stunden. Eine Gelbfärbung der physiologischen Kochsalzlösung zeigt einen positiven ONPG-Test an. Keime, die nach 6 Stunden keine positive Farbveränderung zeigen, sollten bis zu 24 Stunden weiter bebrütet werden. Bleibt die Gelbverfärbung aus spricht dies für ein negatives Testergebnis.

Arbeitsmittel, Reagenzien, Nährböden

• ONPG-Scheiben
• sterile physiologische Kochsalzlösung