O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

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o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) ist ein artifizielles, chromogenes Substrat für das Enzym β-Galactosidase (LacZ).

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Eigenschaften

Das Enzyms β-Galactosidase hydrolysiert ONPG zu Galactose und dem gelben Farbstoff o-Nitrophenol.

Verwendung

In der Biochemie wird ONPG zur quantitativen Bestimmung der Aktivität der β-Galactosidase verwendet.

Das natürliche Substrat der β-Galaktosidase ist das Disaccharid Laktose. Ähnlich wie X-Gal, das für die qualitative β-Galaktosidasebestimmung verwendet wird, ist ONPG ist Laktosederivat, das für die β-Galaktosidase ein chromogenes Substrat darstellt.

In einem Reaktionsansatz entstehen nach der hydrolytischen Spaltung des farblosen ONPG Galaktose und das gelbgefärbte o-Nitrophenol. Das ONPG muss im Überschuss im Ansatz vorhanden sein. Die Intensität der Gelbfärbung variiert mit der Konzentration der β-Galaktosidase und der Reaktionsdauer. Durch Zugabe von Natriumcarbonat (Verschiebung des pH-Werts in den basischen Bereich (pH 11)) wird die Reaktion abgestoppt, da β-Galaktosidase bei hohen pH-Werten inaktiv ist. Die mit bloßem Auge sichtbare Gelbfärbung sollte nicht zu intensiv sein und sich zwischen 15 Minuten und sechs Stunden nach Reaktionsstart bilden.

Die Menge des entstandenen o-Nitrophenols wird durch Absorption in einem Photometer bei 420 nm bestimmt. Aus der Reaktionsdauer und dem Absorptionswert kann die Aktivität der β-Galaktosidase berechnet werden.

Literatur

J.H. Miller Assay of β-Galactosidase, In J.H. Miller Experiments in Molecular Genetics, S. 352–355, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1972, ISBN 0-87969-106-9

Siehe auch

• X-Gal