MeCAT

Die MeCAT-Metallkodierung (Metal Coded Tagging Technology) ist ein neuartiges Verfahren für die quantitative differentielle Analyse von Proteinen und Peptiden, bei der mehrere unterschiedlich schwere Metalle (89Y, 139La, 140Ce, 141Pr, 159Tb, 165Ho, 169Tm, 175Lu etc.) zur Markierung von Proteinen und Peptiden aus verschiedenen Proben eingesetzt werden. Bei der MeCAT-Analyse werden je nach eingesetztem MeCAT-Reagenz zuerst spezifisch unterschiedliche Aminosäure mit den MeCAT-Metallen markiert (z.B. Cystein oder Lysin). Anschließend werden in Multiplex-Experimenten mehrere Proben zusammengegeben und die Auftrennung der MeCAT-markierten Probengemische mit gängigen Verfahren wie Elektrophorese oder Chromatographie durchgeführt. Mittels massenspektrometrischer Verfahren können die Proteine und Peptide mehrerer Proben gleichzeitig (Multiplex-Analyse) identifiziert und über die Metallmarkierung (Metallkodierung) quantifiziert sowie ihrer jeweiligen Ausgangsprobe zugeordnet werden. Zur Proteinidentifikation kommen dazu bekannte Verfahren wie MALDI-MS, MALDI-TOF-TOF-MS und ESI-MSMS zum Einsatz, die auch eine relative Quantifizierung über ein bis maximal drei Größenordnungen in Analogie zu gängigen isotopenbasierten Markierungsverfahren (ICAT etc.) mit einer Nachweisgrenze im unteren Femtomol-Bereich ermöglichen. MeCAT ermöglicht erstmals den Einsatz von ICP-MS, die eine extrem sensitive und reproduzierbare absolute und relative Quantifizierung von Proteinen und Peptiden gestattet, indem die an die Proteine gebundenen Metalle quantifiziert werden. Dies läßt bei Proteinen, deren Sequenz bekannt ist, eine extakte absolute Quantifizierung zu, während in anderen Fällen 'nur' eine relative Quantifizierung zwischen den Proben der Multiplex-Analysen möglich ist. Die analytische Nachweisegrenze liegt zur Zeit im unteren ppt-Bereich, was einer Detektion von intakten Proteinen im Attomol-Bereich entspricht. Damit ermöglicht MeCAT eine erheblich sensitivere Proteinquantifizierung als etablierte Analyseverfahren und bietet durch technische Verfahrensoptimierung das Potential die Nachweisgrenze bis in den unteren ppq-Bereich zu verbessern. Dadurch wird es prinzipiell möglich, wenige Millionen, mehrere hunderttausend oder gar weniger Proteinmoleküle zu quantifizieren, je nachdem mit wievielen MeCAT-Metallmolekülen ein Protein markiert wurde. Bereits in Probenmaterial mit wenigen zehntausend Zellen ist somit der quantitative Nachweis von Proteinen, die in einer oder wenigen Kopien pro Zelle vorliegen, denkbar.

Weiteres empfehlenswertes Fachwissen

Tägliche Sichtkontrolle der Laborwaagen

Dauerhaft genaue Prüfgewichte dank 12 kostenloser Tipps

Leitfaden zu den grundlegenden Laborkenntnissen

MeCAT wurde von der AG Prof. Linscheid, HU Berlin, in enger Zusammenarbeit mit dem Berliner Biotechnikunternehmen Proteome Factory erfunden und wird kontinuierlich weiterentwickelt.

Vorteile von MeCAT

Das MeCAT Verfahren ist eine Alternative zu Verfahren, bei denen stabile Isotopen (12C <-> 13C, 14N <-> 15N) zur differentiellen Markierung von Proteinen zum Einsatz kommen. Es zeichnet sich durch mehrere Vorteile aus:

• Multiplex-Fähigkeit: gleichzeitige Analyse von zwei bis fünf und mehr Proben
• nur ein Reagenz, das mit verschiedenen Metallen bestückt ist
• absolute Quantifizierung mit ICP-MS
• relative Quantifizierung mit MALDI-MS und ESI-MS
• Kompatibel zu gängigen MALDI- und ESI-MS Techniken
• Kompatibel mit Chromatographie und Elektrophorese (z.B. 2D Gelelektrophorese)
• Koelution in der RP-HPLC
• Affintätsaufreinigung über Affinitäts-Tag oder Hapteneigenschaft von MeCAT
• ICP-MS: Externe Kalibrierung mit Metall-Standard-Lösungen
• ICP-MS: Nachweisgrenze: ppt bis ppq Bereich für Lanthanide
• ICP-MS: linearer dynamischer Detektionsbereich: >6-8 Größenordnungen
• ICP-MS: gleichzeitige Detektion von Phosphor, Schwefel und anderen Elementen möglich

Einsatzbereiche von MeCAT

MeCAT wird für die Proteomanalyse (Proteomics, Proteomik) von proteinhaltigen Proben unterschiedlichster Art eingesetzt werden. So liegen Einsatzbereiche in der Krankheitsforschung von Mensch und Tier, in der Pflanzenbiotechnologie, Analyse von Fermentationen und Lebensmitteln. In der Pharmakokinetik können therapeutische Proteine aus Probenmaterial wie Plasma oder Serum extrem sensitiv unter Verwendung eines internen Standards quantifiziert werden. (Dabei wird als interner Standard das therapeutische Protein verwendet, das mit einem anderen MeCAT-Metall als die zu analysierenden komplexen Proben, markiert wurde. Die MeCAT-markierten Proben und der interne Standard werden vor der Proteintrennung und ICP-MS Quantifizierung zusammengegeben, wodurch Probenverluste etc., die bei der Analyse auftreten können, kompensiert werden und damit eine exakte Bestimmung der Konzentration an therapeutischem Protein im Plasma möglich wird.)