Enzymkinetik

Die Enzymkinetik ist ein Teilgebiet der biophysikalischen Chemie. Sie beschreibt, wie schnell enzymkatalysierte chemische Reaktionen verlaufen. Die Enzymkinetik findet breite Anwendung in Biologie und Medizin, da auch biologische Substrate (Reaktionspartner) – darunter solche, die im Menschen auftreten – untersucht werden. Ein Hauptziel der Enzymkinetik ist die Beschreibung der Konzentrationsabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit mit geeigneten Formeln, sowie die Bestimmung der dazugehörigen Parameter für ein bestimmtes Protein (Enzymaktivität und katalytische Effizienz). Da Enzyme dazu dienen, Reaktionen zu beschleunigen und zu lenken, ist die enzymkinetische Analyse zum Verständnis von Enzymfunktionen unerlässlich.

Der klassische Weg der Charakterisierung von Enzymen erfolgt aufgrund der Substrataffinität (reziprok zum K_m-Wert) und der Wechselzahl (molekulare Aktivität V_max, auch k_cat genannt): je größer k_cat und je kleiner K_m, desto größer die katalytische Effizienz ("k_cat-über-K_m"-Kriterium; vergleiche die Abbildung "Hyperbel" zur graphische Ermittlung). Zur Bestimmung dieser Werte dienen darüber hinaus computergestützte Verfahren wie die nichtlineare Regressionsanalyse oder − herkömmlich – graphische Extrapolationsverfahren (Linearisierungen).

Weiteres empfehlenswertes Fachwissen

Empfindlichkeitsprüfung von Laborwaagen

Richtiges Wägen mit Laborwaagen: Die Wägefibel

Dauerhaft genaue Prüfgewichte dank 12 kostenloser Tipps

Direkt-lineare Auftragung

Wenig bekannt ist die Tatsache, dass sich enzymkinetische Parameter bequem und präzise direkt aus einer Sättigungshyperbel gemäß der Abbildung herleiten lassen ("direkt-lineare Auftragung" auch "Cornish-Bowden-Diagramm" genannt). In dieser Hyperbel ist die enzymatische Umsatzgeschwindigkeit v (Y-Achse) als Funktion der Substratkonzentration [S] dargestellt.

Für die direkt-lineare Auftragung überträgt man die Anfangsgeschwindigkeiten des enzymatischen Umsatzes direkt in das v-[S]-Diagramm. Die [S]-Werte sind vor Versuchsbeginn bekannt (eingestellte Substratkonzentrationen); während der Versuchsreihe ist dann der Ordinatenwert für v (die Anfangsgeschwindigkeit) nachzutragen. Im Gegensatz zu normalen Auftragungen werden die Messwerte also nicht als Punkte dargestellt, sondern in Form von Linien, die sich im günstigsten Fall in einem gemeinsamen Punkt schneiden, aus dessen Koordinatenwerten K_m und V_max folgen. Die katalytische Effizienz folgt übrigens aus der Steigung der Tangente an den Ursprung: V_max/K_m; daraus ergibt sich k_cat/K_m.

Die Fehlerbehandlung wird im direkt-linearen Plot weitgehend vereinfacht: die Linien im zweiten Quadranten werden mehr oder weniger um einen Punkt streuen. Mittelwertsbildung gibt dann die wahrscheinlichen Werte für die Parameter K_m und V_max. Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte (nicht identisch mit deren Standardabweichung) können Ausreißer leicht identifiziert und sogenannte Mediane abgelesen werden.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass alle (auch die nachfolgenden) Auswertungverfahren nicht nur für Enzyme, sondern auch für die Bindungsvorgänge von Carriern oder Rezeptoren Gültigkeit haben. Historisch gesehen gab es hier zweifellos Parallelentwicklungen (Hanes und Eadie-Hofstee-Auftragung für Enzyme, Scatchard und Hill-Auftragungen für Carrier).

Linearisierungsverfahren

Klassisch sind zum gleichen Zweck die Linearisierungsverfahren. Diese sind zwar einprägsam und verbreitet, zur Fehlerbetrachtung jedoch mehr oder weniger ungeeignet. Deshalb sollen sie hier nur gestreift werden:

Lineweaver-Burk-Diagramm (doppelt-reziproke Auftragung)

1/v als Funktion von 1/[S].

zur Datenrepräsentation meist verwendet, zur Auswertung jedoch am wenigsten verlässlich. Kleine Fehler in v ergeben bei kleinen [S]-Werten eine große Abweichung in 1/v, bei großen [S]-Werten ist diese eher zu vernachlässigen. Die Autoren der Methode haben die Unsicherheit großer 1/v Werte betont und darauf hingewiesen, dass diese grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender haben dies zumeist ignoriert. Wo möglich sollte dieses Verfahren zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden, vorzugsweise durch das Hanes-Diagramm.

Eadie-Hofstee-Diagramm

Das Eadie-Hofstee-Diagramm nimmt eine Mittelstellung ein.

v als Funktion von v/[S].

Der Fehler wächst mit v/[S]. Da v bei beiden Koordinaten eingeht, konvergieren alle Abweichungen zum Ursprung.

Scatchard-Diagramm

Das Scatchard-Diagramm

v/[S] als Funktion von v.

gleicht dem vorigen (Achsen sind vertauscht) und wird zumeist zur Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle enzymkinetischer Daten) angewendet. Scatchard- und Eadie-Hofstee-Diagramme gelten als die besten Werkzeuge zur Diagnose kooperativer Phänomene. Im Falle negativer Kooperativität oder nicht-identischer, isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver Verlauf mit linearem Endast. Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten (K_d beziehungsweise K_m) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze (aktiven Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der x-Achse abzulesen.

Hanes(-Wilkinson)-Diagramm (Hanes-Woolf-Diagramm)

[S]/v als Funktion von [S].

Bestmögliche Auftragung dieses Typs. Fehler in [S]/v sind eine weit bessere Annäherung der Fehler in v. Aufgrund einer unverfälschten Spreizung der Messpunkte entlang der [S]-Achse wird das Ergebnis durch einzelne Ausreißer prinzipiell weniger verfälscht. Nur bei dieser Auftragung kann auch eine Datenoptimierung durch lineare Regression sinnvoll sein. Der Anstieg der Regressionsgeraden beträgt 1/v_max, der Schnittpunkt mit der Y-Achse entspricht K_m/v_max.

Hill-Diagramm

Graphische Methode, vorrangig für die Bestimmung eines kooperativen Bindungsvorganges für ein Protein (Enzym). Gebunden werden Substrate S (bzw. Liganden L) Die Graphik setzt Kenntnis von Vmax (beziehungsweise n) voraus. Die Auftragung von

log v/(V_max-v) als Funktion von log [S] beziehungsweise

log r/(n-r) als Funktion von log [L]

ist eine Gerade der Steigung 1 (n_H = 1), wenn die Bindungsplätze voneinander unabhängig sind. Bei kooperativen Systemen kann die Steigung am Nullpunkt (der Hill-Koeffizient n_H) theoretisch der Zahl der Untereinheiten (n) gleichen, wird aber praktisch darunter bleiben. Falls die individuellen K_m-(K_d-)Werte nicht durch Tangenten an die 45°- Ausläufer der Kurve extrapolierbar sind, ist n_H ein Ersatzmaß der Kooperativität einzusetzen; nur für n_H = 1 gleicht der Nulldurchgang ln K_m (beziehungsweise ln K_d). Für Hämoglobin (n = 4), das als klassisches, hochkooperatives Protein gilt, wurde n_H zu 2,8-2,9 bestimmt.

Inhibitoren

Viele Therapeutika – auch Kampfstoffe – sind Hemmstoffe oder Mediatoren (Inhibitoren) von Enzymen. Aus diesem Grunde ist der Aufklärung des Wirkungsmechanisms immer eine besondere Bedeutung zugekommen. Hier sollte allerdings beachtet werden, dass sich klassische Analysen auf reversibel bindende Stoffe beschränken. Enzymgifte als "nichtkompetitive Inhibitoren" zu beschreiben ist zwar gängig, aber nicht korrekt.

Abgeleitet aus der Michaelis-Menten-Gleichung (v = V_max x [S] / (K_m + [S]) stellt sich die allgemeine Inhibitionsgleichung wie folgt dar:

Danach kann das Verhältnis des K_i-Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EI) und des Kis-Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EIS) zur Ableitung des Inhibitionstyps dienen:

A – Mischtyp.

Der Inhibitor bindet sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym-Substratkomplex. Km und Vmax werden nicht erreicht. Im Sonderfall des nichtkompetitiven Inhibitors wäre K_i=K_is. K_m bliebe unverändert, aber V_max würde nicht erreicht.

B – Kompetitiv.

Der Inhibitor bindet anstelle des Substrats. K_m kann nicht erreicht werden, während V_max mit steigendem Substratüberschuss angenähert wird. K_is hat keine Bedeutung, das heißt, es ist unrealistisch groß.

C – Unkompetitiv.

Der Inhibitor assoziiert nur, nachdem das Substrat bereits gebunden ist. V_max kann nicht erreicht werden, während der K_m-Wert scheinbar sinkt(!). Ki hat keine Bedeutung, das heißt, es ist unrealistisch groß.

Reversible Hemmtypen werden häufig als kompetitiv, nichtkompetitiv oder unkompetitiv klassifiziert, obgleich sie ursprünglich auf der Grundlage von Einsubstratenzymen definiert wurden. Mit Ausnahme der kompetitiven Hemmung sind sie jedoch nur für Mehrsubstratenzyme von Bedeutung. Die klassische Vorgehensweise beruht übrigens wieder auf der Inspektion linearisierter Graphiken (Details im Kapitel Enzymhemmung), für die der Einfluss eines Inhibitors I auf den K_m- beziehungsweise V_max-Wert diskutiert wird. Die Zukunft sollte der nichtlinearen Regressionsanalyse auf der Basis der allgemeinen Inhibitionsgleichung gehören.

Siehe auch

Allosterie, Crabtree-Effekt, Energieladung, Enzymaktivität und katalytische Effizienz, Enzymhemmung, exergon, Fließgleichgewicht, Kooperativität, Mehrsubstratreaktion, Michaeliskonstante, Michaelis-Menten-Theorie, Multienzymkomplexe, Pasteur-Effekt, Substratzyklus, Wechselzahl