Ligation-During-Amplification

Ligation-During-Amplification (LDA) ist eine molekularbiologische Methode zur linearen Amplifikation von zirkulärer DNA (z.B. Plasmid) mit nur einem sequenzspezifischen Primer unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase sowie einer thermostabilen DNA-Ligase.^[1][2][3]

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Diese Methode wird genutzt zur gezielten Mutagenese von Plasmiden. Dabei wird mit einem mutagenen Primer ein Strang der zirkulären Plasmid-DNA (Template) in einem Thermocycler in mehreren Zyklen linear amplifiziert und ligiert. Anschließend wird die parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem Restriktionsenzym DpnI, welches nur dam methylierte DNA spaltet, abgebaut. Danach wird die amplifizierte, mutierte, einzelsträngige, zirkuläre DNA in Bakterien transformiert und dort zur doppelsträngigen Plasmid-DNA vervollständigt.

Im QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene wird ebenfalls die Methode der LDA-Mutagenese mit nur einem Primer genutzt. Im Gegensatz dazu wird im normalen QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit die Methode der PCR-Mutagenese mit zwei Primern verwendet.

Literatur

1. ↑ Chen, Z. & Ruffner, D.E. (1998): Amplification of closed circular DNA in vitro. In: Nucleic Acids Res. Bd. 26, S. 1126-1127. PMID 9461478 PDF
2. ↑ Shenoy, A.R. & Visweswariah, S.S. (2003): Site-directed mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide and DpnI digestion of template DNA. In: Anal. Biochem. Bd. 319, S. 335-336. PMID 12871732 doi:10.1016/S0003-2697(03)00286-0
3. ↑ Sawano, A. & Miyawaki A. (2000): Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis. In: Nucleic Acids Res. Bd. 28, S. E78. PMID 10931937 PDF

Siehe auch

• Mutagenese

Weblink

• Lab-Protokol (PDF Format)
• The Primer Generator – Automated generator of primers for site-directed mutagenesis
• PrimerX – Automated design of mutagenic primers for site-directed mutagenesis