Lichtmikroskop

  Mikroskope sind Geräte, mit denen stark vergrößerte Bilder von Objekten erzeugt werden können. Beim Lichtmikroskop wird diese Vergrößerung durch die Ausnutzung optischer Effekte erzielt.

Neben der normalen Lichtmikroskopie gibt es eine Vielzahl von lichtmikroskopischen Spezialverfahren, etwa Phasenkontrast-, Interferenzkontrast-, Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie.

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Prinzip

  Das grundlegende Ziel eines Lichtmikroskopes (griechisch: μικρόν (micron) = klein+ σκοπεῖν (skopein) = etwas ansehen) ist die Erhöhung der Vergrößerung der Auflösung von Details die mit dem bloßen Auge nicht wahrgenommen werden können. Hier wird von den Begrenzungen des menschlichen Sehapparates ausgegangen, welches nur über eine begrenzte Brechkraft (Dioptrie) verfügt und so nur eine begrenzte numerische Apertur verwenden kann. Als weitere Limitation sind die unterschiedlichen Aberrationen zu finden, die das kleinste abbildbare Volumen begrenzen. Im Prinzip wird das Objekt vergrößert abgebildet (Bildvergrößerung) und dieses dann mit einer Lupe betrachtet, um dieses aus einer größeren "Nähe" als es mit dem Auge möglich wäre betrachten zu können. Im letzen Schritt werden die Winkel vergrößert (Winkelvergrößerung).

Bauformen

Einfache und zusammengesetzte Mikroskope

Als einfache Mikroskope werden optische Linsen bezeichnet, die eine starke Vergrößerung ermöglichen. Der Übergang zu einer im Prinzip genauso funktionierenden aber schwächer vergrößernden Lupe ist dabei fließend. Die heute üblichen Mikroskope sind dagegen zusammengesetzte Mikroskope, die so heißen, weil sie aus zwei Linsensystemen zusammengesetzt sind: Das vorderste optische Element, das Objektiv (siehe auch Abbildung), erzeugt ein Zwischenbild, welches vom Okular erneut vergrößert wird.

Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie

Je nach der angewendeten Beleuchtungstechnik kann ein Mikroskop für Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie verwendet werden. Bei der Durchlichtmikroskopie wird das Licht durch das Präparat hindurchgeleitet, bevor es vom Objektiv des Mikroskops aufgefangen wird. Daher sind durchsichtige oder dünn geschnittene Präparate erforderlich. Bei der Auflichtmikroskopie wird das Licht entweder vom Mikroskop kommend durch das Objektiv auf das Präparat geleitet oder von der Seite eingestrahlt (schräge Beleuchtung). Das am Präparat reflektierte Licht wird wiederum vom Objektiv aufgefangen. Auflichtmikroskopie kann demnach auch für undurchsichtige Präparate verwendet werden, zum Beispiel in den Materialwissenschaften.

Aufrechte, umgekehrte oder inversen Mikroskope

Aufrechtes Mikroskop ist eine allgemeine Bezeichnung für Mikroskope, bei denen das Objektiv von oben auf das Präparat schaut (wie in der Abbildung). Im Gegensatz dazu ist bei einem umgekehrten oder inversen Mikroskop das Objektiv unter dem Tisch angebracht, der vergrößerte Raum zwischen Beleuchtungseinheit und Tisch erlaubt das Mikroskopieren von Präparaten mit größerer Dicke (einige bis über 10 Zentimeter) und durch die Wände von Laborgefäßen hindurch. Mikroskope mit dieser Bauform sind ein unerlässliches Instrument für Untersuchungen an lebenden Zellen in Kulturgefäßen (Zellkultur), in der Patch-Clamp-Technik sowie bei Einsatz von Mikromanipulatoren, die von oben an das Präparat herangeführt werden.

Leistungsfähigkeiten

Bei optimaler Gerätebeschaffenheit und der Verwendung von Ölimmersion lassen sich mit klassischer Lichtmikroskopie, wie sie im Wesentlichen im 19. Jahrhundert entwickelt wurde, bestenfalls Objekte voneinander unterscheiden, die 0,2 bis 0,3 µm oder weiter voneinander entfernt sind.^[1] Die erzielbare Auflösung ist dabei nicht etwa durch die Qualität der Geräte, sondern durch physikalische Gesetze bestimmt. Sie hängt unter anderem von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab.

Verfahren, die seit den neunziger Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelt wurden, erlauben für Spezialfälle auch eine Auflösung unter diesem so genannten Abbe-Limit.

Geschichte

Es ist nicht möglich, einen „Erfinder“ des Mikroskopes zu benennen. Das Prinzip der Vergrößerung durch mit Wasser gefüllte Glasschalen wurde bereits von den Römern beschrieben (Seneca) und Vergrößerungslinsen waren schon im 16. Jahrhundert bekannt.

Der niederländische Brillenmacher Hans Janssen und sein Sohn Zacharias Janssen werden häufig als die Erfinder des ersten zusammengesetzten Mikroskopes im Jahr 1590 angesehen. Dies basiert jedoch auf einer Erklärung von Zacharias Janssen selbst aus der Mitte des 17. Jahrhunderts. Das Datum ist dabei fragwürdig, da Zacharias Janssen selbst erst 1590 geboren wurde. Galileo Galilei entwickelte 1609 das Occhiolino, ein zusammengesetztes Mikroskop mit einer konvexen und einer konkaven Linse. Allerdings hatte Zacharias Janssen ein Gerät mit dem gleichen Funktionsprinzip bereits ein Jahr zuvor auf der Frankfurter Messe vorgeführt. Galileis Mikroskop wurde von der „Akademie der Luchse“ in Rom gefeiert, die im Jahr 1603 von Federico Cesi gegründet worden war. Eine Zeichnung des Akademiemitglieds Francesco Stelluti von 1630 gilt als älteste Zeichnung, die mit Hilfe eines Mikroskops angefertigt wurde. Auf ihr sind drei Ansichten von Bienen (von oben, unten und von der Seite) sowie Detailvergrößerungen zu sehen. Die Biene kam im Wappen der Barberini Familie vor, zu der Papst Urban VIII. gehörte. Stelluti schrieb in ein Banner oberhalb der Abbildung: „Für Urban VIII. Pontifex Optimus Maximus ..... von der Akademie der Luchse, und in ewiger Verehrung widmen wir Euch dieses Symbol“ ^[2].

Christiaan Huygens (1629-1695), ebenfalls Niederländer, entwickelte im späten 17. Jahrhundert ein einfaches Zwei-Linsen-Okularsystem. Es war achromatisch korrigiert, hatte also weniger Farbfehler und war deshalb ein großer Fortschritt in der Entwicklung des Mikroskopes. Okulare nach Huygens werden bis heute produziert, sind jedoch im Vergleich zu modernen Weitfeldokularen optisch deutlich unterlegen.

Auch Robert Hooke benutzte für die Zeichnungen seiner 1665 publizierten „Micrographia“ ein zusammengesetztes Mikroskop (siehe Abbildung). Die stärksten Vergrößerungen, die er in seinem Buch darstellte, waren 50-fach. Stärkere Vergrößerungen waren nicht möglich, da sich die Abbildungsfehler, die in der Frontlinse (Objektiv) und im Okular entstanden, multiplizierten, so dass keine Details mehr zu erkennen waren.

  Antoni van Leeuwenhoek (sprich: Lee-u-hen-huk) (1632-1723) verfolgte daher einen anderen Ansatz. Die Vergrößerung einer Linse ist um so stärker, je stärker sie gewölbt ist. Kleine, annähernd kugelförmige Linsen haben daher die stärkste Vergrößerung. Leeuwenhoek war brillant im exakten Schleifen kleinster Linsen, eine Technik, die zuvor nur unzureichend gemeistert worden war. Seine einfachen Mikroskope mit nur einer Linse waren zwar unhandlich zu benutzen, doch da er nur mit einer Linse mikroskopierte, entfiel die Multiplikation der Abbildungsfehler. Seine Mikroskope hatten eine bis zu 270-fache Vergrößerung. So entdeckte Leeuwenhoek die von ihm so genannten „Animalkulen“, einzellige Bakterien und Protozoen.

Im Jahre 1768 beschrieb der Duc de Chaulnes (1714 - 1769, vollständiger Name: Michael Ferdinand d'Albert d'Ailly Duc de Chaulnes) das erste eigens für Messzwecke konzipierte Messmikroskop.

Robert Brown benutzte noch 1830 ein einfaches Mikroskop und entdeckte damit den Zellkern und Brownsche Molekularbewegung. Es dauerte 160 Jahre, bevor zusammengesetzte Mikroskope die selbe Abbildungsqualität erzeugten, wie Leeuwenhoeks einfaches Mikroskop.

Bis weit ins 19. Jahrhundert hinein wurden gute zusammengesetzte Mikroskope durch ausprobieren und anhand von Erfahrungswerten hergestellt. Ernst Abbe erarbeitete um 1880 die zum Bau besserer Mikroskope erforderlichen, noch heute gültigen physikalischen Grundlagen. Als Folge gelang es zum ersten Mal, ein Objektiv herzustellen, dessen Auflösungsgrenze nicht mehr durch die Materialgüte, sondern durch die physikalischen Beugungsgesetze limitiert wurde. Diese physikalische Auflösungsgrenze wird als das Abbe-Limit bezeichnet. Produziert wurden die entsprechenden Mikroskope zusammen mit Carl Zeiss in dessen optischen Werkstätten. Dabei profitierten sie von den von Otto Schott entwickelten optischen Gläsern und dem von August Köhler entwickelten Beleuchtungsapparat zur Köhlerschen Beleuchtung.

Prinzip des zusammengesetzten Mikroskops

Das vom Objekt kommende Licht wird durch eine Kombination von mindestens zwei Linsensystemen, dem Objektiv (3) und dem Okular (1), optisch abgebildet. Dabei wird vom Objekt durch das Objektiv ein reelles Zwischenbild erzeugt, welches durch das Okular analog zur Lupe vergrößert betrachtet wird. Die Vergrößerung des Mikroskops ist das Produkt aus Objektivvergrößerung und Okularvergrößerung. Die Objektive sind in der Regel wechselbar, so dass die Vergrößerung der jeweiligen Aufgabenstellung angepasst wird. Der Objektivrevolver (2) ermöglicht den schnellen Objektivwechsel durch Drehen des jeweils gewünschten Objektivs in den Strahlengang. Die Fokussierung erfolgt durch Höhenverstellung des Tubus oder des Objekttischs. Dieser ist häufig auch mit einem verschiebbaren Objekthalter ausgestattet, um das beobachtete Objekt vor dem Objektiv zu positionieren.

Man unterscheidet die Durchlichtmikroskopie, bei der das Objekt transparent oder sehr dünn ist und von der dem Objektiv abgewandten Seite beleuchtet wird, und die Auflichtmikroskopie. Bei dieser wird durch Beleuchtung von der dem Objektiv zugewandten Seite die Oberfläche des Objekts untersucht. Bei der Auf- und Durchlichtmikroskopie unterscheidet man außer der normalen Hellfeldmikroskopie die Dunkelfeldmikroskopie und die Phasenkontrastmikroskopie.

Beleuchtungsoptik

Die Köhlersche Beleuchtung ist die übliche Methode einer Durchlichtanordnung. Sie besteht aus folgenden Elementen:

• Lichtquelle
• Kollektor
• Leuchtfeldblende
• Aperturblende
• Kondensor

Zum Erreichen der optimalen Leistungsfähigkeit eines Mikroskops ist eine korrekte Abstimmung der Blendenabbildung und der Objektabbildung nötig. Das Einstellen dieser Abstimmung wird auch als Köhlern bezeichnet. Bei der Köhlerschen Beleuchtung bildet der Kollektor die Lichtquelle in die Aperturblende ab und gleichzeitig der Kondensor die Leuchtfeldblende in das Objekt.

Auflösung

    Entscheidend für die Fähigkeit eines Mikroskops, Strukturen kleiner Objekte unterscheidbar abzubilden, ist (neben dem Kontrast) nicht die Vergrößerung, sondern die Auflösung. Diese Tatsache ist nicht durch strahlenoptische Überlegung zu verstehen, sondern ergibt sich aus der Wellennatur des Lichts. Der Eisenacher Physiker Ernst Abbe erkannte als erster den entscheidenden Einfluss der Numerischen Apertur auf die Auflösung. Er gab als förderliche Vergrößerung

an. Dies bedeutet, dass die kleinsten vom Objektiv aufgelösten Strukturen nach der Abbildung durch das Okular im Auge noch aufgelöst werden können, also etwa unter einem Winkel von 2° erscheinen. Wird die Vergrößerung höher gewählt (z. B. durch ein Okular mit hoher Vergrößerung), wird das Bild des Objekts zwar größer dargestellt, aber es sind keine weiteren Objektdetails erkennbar. Objektive und Okulare müssen also aufeinander abgestimmt sein.

Nach den Gesetzen der Wellenoptik ist die Auflösung des Lichtmikroskops auf die Größe der Wellenlänge der Beleuchtung beschränkt. Bei blauem Licht liegt sie bei etwa 0,4 µm. Spezialobjektive aus Quarzglas sind für UV-Licht transparent, wodurch sich die Auflösunggrenze auf unter 0,2 µm steigern lässt.

Mit zunehmender Vergrößerung nehmen Arbeitsabstand und Schärfentiefe ab.

Auflösungen jenseits des Abbe-Limits

Seit den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts wurden einige Methoden entwickelt, die eine optische Auflösung jenseits des Abbe-Limits ermöglichen. Sie basieren alle darauf, dass Abbes Theorie nur für unendlich ausgedehnte Objekte gültig ist. Die unendliche Objektausdehnung ist eine Grundvorraussetzung für die beugungsoptischen Betrachtungen, die Abbe zu seiner Berechnung der Auflösungsgrenze führten. Schränkt man den Beobachtungsbereich ein, gilt das Abbe-Limit in seiner ursprünglichen Form nicht mehr. Man spricht darum auch von Superauflösung.

Die Einschränkung des Beobachtungsbereiches kann, wie bei der in den 1950er Jahren erfundenen Konfokalmikroskopie, durch kleine Lochblenden erfolgen oder wie bei der in den 1990er Jahren entwickelten optischen Rasternahfeldmikroskopie durch Abtastung der Oberfläche mit einer sehr kleinen Sonde. Die ebenfalls in den 1990er Jahren entwickelte 4 Pi- und STED-Mikroskopie nutzt gezielte Fluoreszenzanregung in biologischen Proben um den Beobachtungsbereich einzuschränken.

Stimulated emission depletion

Stimulated emission depletion (STED) wurde vom Göttinger Physiker Stefan Hell und seinen Mitarbeitern entwickelt. Er hat Abbes Formel um einen Wurzelterm ergänzt und auf dieser Basis ein neuartiges Fluoreszenzmikroskop mit zehnmal besserer Auflösung entwickelt. Neu an diesem Mikroskop-Verfahren ist, dass die Auflösung nicht mehr durch die Lichtwellenlänge begrenzt wird, sondern nur noch durch die Menge des vom untersuchten Objekt abgestrahlten Lichts (die Zahl der auffangbaren Photonen). Die Funktionsweise ist im Artikel STED dargelegt.

Da die Größe von Proteinkomplexen im Bereich von 10 bis 200 Nanometern liegt, wird diese Technik es möglicherweise erlauben, in molekulare Größenordnungen von Lebewesen vorzudringen. Erste Anwendungen waren erfolgreich: So konnten mit STED-Mikroskopie einzelne Bläschen mit Nervenbotenstoffen (synaptische Vesikel) aufgelöst werden. Anders als bei einem Elektronenmikroskop können mit diesem Verfahren theoretisch auch intakte, lebende Zellen untersucht werden.

Auch für die Herstellung kleinster elektronischer Schaltkreise ist STED möglicherweise interessant. Mit geeigneten schaltbaren Molekülen ließe sich das STED-Prinzip umkehren und zum Herstellen feinster Nanostrukturen verwenden. Obwohl das Verfahren vermutlich für Massenspeicher zu langsam wäre, könnte man beliebig kleine Strukturen mit sichtbarem Licht anfertigen.

Leica Microsystems hat die patentierte STED-Mikroskopie zur Marktreife entwickelt und bietet seit Oktober 2007 ein entsprechendes Gerät an.

Stefan Hell wurde für seine Arbeiten auf diesem Gebiet am 23. November 2006 der mit 250.000,- € dotierte Deutsche Zukunftspreis von Bundespräsident Horst Köhler überreicht.

Lichtmikroskop und Mikrofotografie

  Hauptartikel: Mikrofotografie

Für die fotografische Aufnahme eines Präparates kann eine Kamera mit dem Mikroskop verbunden werden. Dazu ist bei Forschungsmikroskopen in der Regel ein Fototubus vorgesehen, an den das Kameragehäuse ohne weitere Linsen angeschlossen wird. In diesem Fall leuchtet das Zwischenbild den Film bzw. die Sensorfläche (CCD / CMOS) der Kamera vollständig aus, die Okularoptik ist an der Aufnahme nicht beteiligt. Diese Anordnung bietet zahlreiche Vorteile:

• die Qualität der Aufnahme wird nicht durch zusätzliche optische Elemente beeinträchtigt
• die Kamera ist mechanisch steif mit dem Mikroskop verbunden
• die Okularoptik bleibt für die Wahl des Bildausschnittes frei
• bei Verwendung von Bajonettverschlüssen kann das Kameragehäuse in wenigen Sekunden gewechselt werden
• durch Anpassung über Zwischenringe können verschiedene Aufnahmeformate eingesetzt werden.

Bei Mikroskopen ohne Fototubus ist es aber durchaus möglich, eine Kamera, auch ohne Anpassungen, direkt ans Okular zu halten und mit ruhiger Hand auszulösen. Besonders wichtig ist die Ausrichtung der optischen Achse des Kameraobjektivs auf die des Mikroskopokulars. Nicht jede Kamera ist dafür geeignet, viele preisgünstige Modelle erlauben dies aber. Durch mangelnde optische Anpassung ist meist nur ein verkleinertes, an den Rändern abgeschattetes (→ Vignettierung) Bild zu bekommen. Eine etwas bessere, aber auch teurere Lösung besteht darin, einen Tubus-Adapter zu verwenden, mit dem verbunden die Kamera anstelle des Okulars in den Tubus eingeführt wird. Der Adapter übernimmt die mechanische und optische Anpassung zwischen Mikroskop und Kamera. Dadurch vermeidet man Verwacklungsunschärfen und eine Vignettierung des Bildes, die resultierende Fotoqualität ist wesentlich höher.

Meist bieten Hersteller von Forschungsmikroskopen zugleich Kameragehäuse an, die speziell auf ihre eigenen Fabrikate zugeschnitten sind und so eine bessere Steuerung der Belichtung ermöglichen. Weiterentwicklungen der Mikrofotografie bestehen in der Übertragung der digitalisierten Aufnahmen an eine Workstation zur softwaregesteuerten, automatisierten Bildauswertung - nicht nur von Einzelbildern, sondern auch ganzen Serien, wie histologischen Schnitten.

Siehe auch

• Elektronenmikroskop
• Rasterkraftmikroskop
• Konfokalmikroskop
• Röntgenmikroskopie

Quellenangaben

1. ↑ Ernst Abbe, "Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung," Archiv für Mikroskopische Anatomie 9, S. 413-468, 1873.
2. ↑ Stephen Jay Gould, Die Lügensteine von Marrakesch, pp. 52-53 S. Fischer Verlag, 2003