Konfokalmikroskop

Ein Konfokalmikroskop ist eine Variante des Lichtmikroskopes, hauptsächlich des Fluoreszenzmikroskops, mit dem virtuelle optische Schnitte durch ein Objekt erzeugt werden können. Diese Schnittbilder können anschließend durch geeignete Software zu einer räumlichen Darstellung zusammengesetzt werden.

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Prinzip

  In einem normalen Lichtmikroskop ist das Bild eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte in der Fokalebene und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb dieser. In einem Konfokalmikroskop wird das Anregungslicht in die Probe hineinfokussiert, Licht aus diesem Fokus wird nun in der Regel durch das gleiche Objektiv auf eine Lochblende abgebildet und gelangt von dort auf einen Detektor (meist ein Photomultiplier oder eine Lawinenfotodiode (englisch Avalanche photodiode, APD)). Anregungs- und Detektionsfokus liegen konfokal, also übereinander.

Optische Information, die nicht aus der Fokalebene kommt, wird somit zweifach unterdrückt: Erstens wird sie nicht "abgefragt" , da die Beleuchtungsintensität außerhalb des Fokus schwach ist, und zweitens wird Licht von außerhalb der Fokalebene nicht auf die Lochblende fokussiert sondern erscheint dort als Scheibchen, so dass es fast komplett geblockt wird. Dies ist in der Abbildung für einen Punkt hinter der Fokalebene dargestellt (gestrichelte Linie).

Da man lediglich Licht aus einem Punkt der Probe erhält, ist es notwendig die Probe abzurastern und das Bild am Computer zusammenzusetzen.

Wie bei einem Lichtmikroskop begrenzt Beugung die Auflösung. Bei blauem Licht beträgt sie ca. 200 nm lateral und 500 nm axial.

Technische Ausführung

Es gibt zwei Grundtypen von konfokalen Mikroskopen: konfokale Laser-Rastermikroskope und konfokale Weißlichtmikroskope.

Konfokales Laser-Rastermikroskop

Die meisten Konfokalmikroskope sind Laser-Rastermikroskope (oder CLSM für confocal laser scanning microscope), deren Prinzip 1955 von Marvin Minsky entwickelt wurde. Bei diesen rastert ein Laserstrahl punktweise ein Objekt, wobei er in der Fokusebene der zu mikroskopierenden Probe maximal fokussiert ist. Es werden nun die Fluoreszenzmoleküle angeregt, die sich im Lichtweg des fokussierten Laserstrahles befinden. Bildet man die Fluoreszenzsignale nun wieder auf einer Bildebene ab, in der sich eine kleine Lochblende befindet, so können nur die Signale, die aus der Fokusebene kommen, exakt in dieses pinhole fallen. Die Signalanteile, die aus anderen Ebenen oberhalb oder unterhalb der Fokusebene in der Probe stammen, werden dadurch ausgeblendet und es kommt zu einer Schichtaufnahme. Hinter der Lochblende befindet sich ein lichtempfindlicher Empfänger, aus dessen Signal dann punktweise ein (Schnitt-)Bild zusammengesetzt wird. Der Durchmesser der Blende bestimmt nun zusammen mit dem Mikroskopobjektiv und dessen numerischer Apertur die Dicke des optischen Schnittes. Die Dicke der abgebildeten Schicht kann bei sehr enger Blende und sehr guten Objektiven auf Werte unter 1 µm eingegrenzt werden. Zeichnet man mehrere Schnitte in verschiedenen Fokusebenen auf, so erhält man eine Schichtung und kann daraus am Computer eine dreidimensionale Rekonstruktion des abgebildeten Objektes erstellen.

Typische Laser-Scanning-Mikroskope sind komplexe Systeme, die aus folgenden Komponenten bestehen:

• einem klassischen Mikroskop
• einem oder mehreren Lasern
• einem Scankopf
• Hardware und Software zur Steuerung der Signalerfassung, -auswertung, -darstellung und -archivierung

Konfokales Weißlichtmikroskop

Verwendet man weißes (d.h. aus unterschiedlichen Wellenlängen bestehendes) Licht anstelle eines Lasers, so werden auch Farbabbildungen mit einem konfokalen Mikroskop möglich. Allerdings lässt sich weißes Licht nicht mit so hohen Intensitäten auf das Objekt fokussieren, wodurch sich die Beobachtungszeiten verlängern. Darum verfügen konfokale Weißlichtmikroskope meist über mehrere parallele Strahlengänge, die eine gleichzeitige Beobachtung mehrerer Stellen auf dem Objekt ermöglichen. Mit geschickten Anordnungen wie einer Nipkow-Scheibe zur Strahlführung ist so eine Abbildung in Echtzeit möglich. Alternativ, aber aufwendiger, kann weißes Licht auch mit einem Pulslaser erzeugt werden: Selbstphasenmodulation

Siehe auch

• 4Pi-Mikroskop
• STED-Mikroskop
• Rastersondenmikroskopie
• Abtastende Optische Kohärenztomografie