Immunpräzipitation

Eine Immunpräzipitation (IP, auch Ko-Immunpräzipitation genannt) ist eine molekularbiologische Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Nachweis der Protein-Interaktion erfolgt bei einer IP in vitro, indem mit Hilfe eines Antikörpers ein bestimmtes Protein samt Interaktionspartner aus einem Proteingemisch heraus präzipitiert wird. Das präzipitierte Protein und seine Interaktionspartner werden im Western Blot nachgewiesen.

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Ablauf

Das Proteingemisch kann ein Homogenat eines Gewebes sein oder aber Zellen aus der Zellkultur. Die Zellkultur ermöglicht es dabei auch, die Partner der vermuteten Interaktion zu überexprimieren, d.h. diese Proteine werden vermehrt gebildet. Der Interaktionspartner sollte in dieser Situation noch an den anderen gebunden sein. Nachdem Zellen oder Gewebe aufgebrochen wurden, gibt man nun einen Antikörper hinzu, welcher an eines der Proteine spezifisch bindet. Über diesen Antikörper wird dann das gesuchte Protein samt Interaktionspartner herausgezogen. Hierbei bedient man sich der spezifischen Eigenschaften von so genanntem Protein A und/oder Protein G, welches ein Bestandteil der Zellwand von bestimmten Streptokokken-Stämmen ist. Protein A und G binden mit hoher Spezifität an die Fc-Region der meisten Säugetier-Immunglobuline. Mit diesen Proteinen werden nun Kügelchen beschichtet (sogenannte Beads, z.B. aus Sepharose), um in einer solchen Immunpräzipitation die Antikörper-Protein-Komplexe an sich zu binden. Die Isolierung der Komplexe erfolgt nun in der Regel über Zentrifugation sowie mehrere Waschschritte, um unspezifische Proteine zu entfernen. Die Proteine werden von den Beads durch Denaturierung gelöst und der Nachweis erfolgt über einen Western Blot.

Vor- und Nachteile

Eingesetzt wird die IP in der Molekularbiologie als alternativer Nachweis einer Interaktion, z. B. nach einem Hefe-Zwei-Hybrid-Screen. Sie ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in zumindest in vivo-ähnlichen Verhältnissen, d. h. im Milieu einer Zelle und mit in Eukaryoten vorkommenden posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung (Anhängen von Zuckerketten), Palmitoylierung (Anhängen von Fettsäuren) oder Faltung durch Chaperone.

Es ist aber möglich, dass sich Proteine durch das Aufbrechen der Zellen verändern oder auch abgebaut werden. Der Erfolg der IP ist auch zu großem Maße von der Bindung des Antikörpers abhängig. Somit können leicht falsch-negative Ergebnisse produziert werden (false negative), die nur durch wiederholte Versuchsserien mit veränderten Bedingungen behoben werden können. Auf der anderen Seite binden manche Proteine auch direkt an die Beads oder an die Oberfläche der Reaktionsgefäße. Diese können eine nicht vorhandene Interaktion vorgaukeln (false positive), welche nur über zusätzliche Kontrollen behoben werden kann.

Des Weiteren ist es möglich, dass zwei Proteine zwar im IP-Versuch interagieren, aber im Zellzyklus, im Zellorganell oder im Zelltyp nicht gleichzeitig auftreten und deshalb nicht tatsächliche Interaktionspartner sein können.

Aus den genannten Gründen muss die Interpretation von IP-Ergebnissen mit Vorsicht erfolgen. Positive Interaktionen müssen immer mit weiteren Techniken aus der Molekularbiologie verifiziert werden, wie beispielsweise Hefe-Zwei-Hybrid-System oder FRET. Das IP-Experimente gibt weiterhin zwar Auskunft über die mögliche Interaktion von zwei Proteinen, jedoch keine Informationen darüber, wie diese Interaktion stattfindet. Dazu sind detailliertere Untersuchungen der Struktur der beteiligten Proteine nötig.

Siehe auch

• Chromatin-Immunopräzipitation