Gram-Färbung

    Die Gram-Färbung ist eine Methode zur differenzierenden Färbung von Bakterien. Sie ist nach dem dänischen Arzt und Bakteriologen Hans Christian Gram benannt, der sie am Ende des 19. Jahrhunderts entwickelte. Verschiedene Bakterien reagieren auf diese Färbung unterschiedlich. Daraus folgt eine Einteilung in sog.

• grampositive (korrekt aber wenig gebräuchlich: Gram-positive) Bakterien, die nach dem Färbegang dunkelblau erscheinen, und
• gramnegative (Gram-negative) Bakterien, die ungefärbt sind. Sie können nachträglich mittels Fuchsin rot gefärbt werden (bei Verwendung der Phasenkontrastmikroskopie ist dies nicht mehr notwendig.)
  

Dies ist ein wichtiges Kriterium für die Unterscheidung verschiedener Bakterien nach der Struktur ihrer Zellwand.
Bedeutend ist das Färbeverfahren beispielsweise bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten. „Grampositive“ und „gramnegative“ Bakterien reagieren unterschiedlich auf Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (in etwa fünf Minuten) anhand eines Abstriches das „Gramverhalten“ der Bakterien bestimmen. Damit hat man die Möglichkeit, sofort mit einer oft lebensrettenden antibiotischen Therapie zu beginnen, bevor das Ergebnis der oft mehrere Tage dauernden definitiven Identifizierung der bakteriellen Erreger vorliegt.

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Methode der Gram-Färbung

Die Färbung setzt sich aus den drei Stufen Färben-Entfärben-Gegenfärben zusammen.

In der ersten Phase wird mit Karbol-Gentianaviolett (eine Lösung von Gentianaviolett mit Zusatz von 15 g/l Phenol) eingefärbt, wodurch alle Bakterien, grampositive wie auch gramnegative, gefärbt werden. Durch eine nachfolgende Behandlung mit Lugolscher Lösung bilden sich größere Farbstoff-Komplexe, die Bakterien erscheinen dunkel blau-violett.

In der entscheidenden zweiten Phase verhalten sich grampositive und gramnegative Bakterien verschieden: Die Behandlung mit Alkohol (96 % Ethanol) führt dazu, dass gramnegative Bakterien wieder entfärbt werden, während bei grampositiven Bakterien die blauen Farbstoff-Komplexe mit dem Alkohol nicht ausgewaschen werden können. Dieser Unterschied ist auf den Aufbau der Zellwand zurückzuführen:

• Grampositive Bakterien besitzen eine der Membran aufgelagerte dicke, mehrschichtige Mureinhülle (Peptidoglykane), in den Zwischenräumen sammelt sich die Lugolsche Lösung an. Hier wirkt der Alkohol dehydrierend und verringert den Abstand zwischen den Molekülen, so dass die Farbstoff-Komplexe nicht vom Alkohol ausgewaschen werden können.
• Gramnegative Bakterien hingegen besitzen nur eine dünne Mureinhülle, der zusätzlich eine zweite Lipid-Membran aufgelagert ist. Der Alkohol wirkt hier lipidlösend, so dass die dünne Mureinhülle freigelegt wird. Die Farbstoff-Komplexe werden vom Alkohol ausgewaschen - das Bakterium wird entfärbt.

Die Behandlungen mit Lugolscher Lösung und mit Alkohol sind somit die entscheidenden Schritte bei der Gramfärbung.

Zur Darstellung der Gram-negativen Bakterien können diese abschließend mit verdünntem Karbolfuchsin (eine Lösung von Fuchsin mit Zusatz von 4,5 g/l Phenol, Fuchsin und Phenol etwa 1/10 der üblichen Konzentration) gegengefärbt werden, worauf sie rot erscheinen. Dies ist jedoch in der heutigen Praxis nicht mehr nötig, wenn die bereits erwähnte Phasenkontrastmikroskopie angewendet wird.

Grafik zum Veranschaulichen

Andere Methoden zur Unterscheidung von grampositiven und gramnegativen Bakterien

KOH-Test

Eine kleine Menge Bakterienmasse (von einer Agar-Kultur) wird in einem Tropfen 3 %iger KOH-Lösung suspendiert. Bei grampositiven ist diese Lauge zu schwach, um die Zellwand zu lysieren. Zieht man eine Nadel (oder Zahnstocher) durch das Gemisch, verhält es sich wie eine Flüssigkeit mit einer Viskosität wie Wasser (keine Fadenbildung zu erkennen). Die Zellwand von gramnegativen Bakterien dagegen ist wesentlich dünner und wird durch die Kalilauge lysiert. Die Zellen brechen auf und die DNA wird freigesetzt. Wird die Nadel durch diese Lösung gezogen, kann aufgrund der erhöhten Viskosität durch die freigesetzte DNA eine Fadenbildung beobachtet werden. Es sei betont, dass es sich hier um einen Schnelltest handelt, der nur bedingt zuverlässig ist. Grade für den Anfänger ist es oft schwer eine Fadenbildung zu erkennen. Eine Fehlerquelle hierbei kann des Weiteren auch die Verwendung einer falschen Laugenkonzentration darstellen. Ist diese zu stark, werden auch gram-positive Bakterien lysiert. Ist sie hingegen zu schwach, werden auch gram-negative Bakterien nicht lysiert.

Aminopeptidasetest

Der Aminopeptidasetest beruht darauf, dass das Enzym L-Alaninaminopeptidase, von wenigen Ausnahmen abgesehen, nur bei gramnegativen Bakterien nachgewiesen werden kann. Eine kleine Menge der zu untersuchenden Bakterien wird in einem Reagenzglas oder Eppendorfcup in etwas sterilem, destilliertem Wasser suspendiert. Zum Nachweis wird L-Alanin-4-nitroanilid verwendet, welches durch das Enzym unter Spaltung einer Amidbindung in L-Alanin und das gelb gefärbte 4-Nitroanilid gespalten wird. Somit zeigt eine Gelbfärbung der Suspension das Vorliegen eines gramnegativen Bakteriums an. Für diese Reaktion sind industriell hergestellte Teststreifen erhältlich. Es ist ratsam hierbei immer eine Negativkontrolle mit anzusetzen um einen Vergleich zu haben. Außerdem ist der Test nur bei Bakterienkolonien ohne starke Eigenfärbung anwendbar.

Historisches

Der dänische Mediziner (Hans) Christian Gram entwickelte die Färbemethode als Mitarbeiter bei Carl Friedländer in Berlin. Er suchte nach einer Färbemethode, mit der Bakterien in tierischen Geweben dargestellt werden können, also kontrastierend zu den Gewebezellen gefärbt wurden. Die gefundene Färbemethode, veröffentlicht 1884, hatte jedoch nur bei einigen Bakterien, den grampositiven, Erfolg. Emile Roux wendete die Methode zur färberischen Differenzierung von grampositiven und gramnegativen Bakterien an, insbesondere zur Identifizierung von Gonokokken (gramnegativ im Gegensatz zu vielen anderen Kokken) (Veröffentlichung 1886).

Grampositive Bakterien

Beispiele für grampositive Bakterien: Alle Arten der Stämme Actinobacteria (z.B. die Aktinomyzeten) und Firmicutes. Beispiele für Firmicutes: die Streptokokken, Enterokokken, Staphylokokken, Listeria, Bacillus, die Clostridien, Lactobazillen und Erysipelothrix rhusiopathiae.

Eine Ausnahme des Stammes Firmicutes, zu dem eigentlich nur gram-positive Bakterien gestellt werden, bilden die Veillonellen (Gattung Veillonella der Familie Acidaminococcaceae). Gattungen dieser Familie sind gram-negativ.

Gramnegative Bakterien

Beispiele für gramnegative Bakterien: Alle Arten der Abteilung Proteobacteria sind gram-negativ, so z. B. die Enterobakterien (Escherichia coli, Salmonella und Enterobacter). Weitere Beispiele der Proteobakterien: Pseudomonas, Legionella, die Neisserien, Rickettsia und Pasteurella multocida.

Auch Streptobacillus moniliformis (eine Art des Stammes Fusobacteria), die Chlamydien (genauer die Gattungen Chlamydophila und Chlamydia der Abteilung Chlamydiae), die Spirochäten, alle Arten des Stammes Bacteroidetes und die Cyanobakterien sind gram-negativ.

Literatur

C. Gram: Über die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. In: Fortschritte der Medicin. Vol. 2, 1884, S. 185-189.