Gateway-Klonierung

Bei der Gateway-Klonierung handelt es sich um eine von der Firma Invitrogen vertriebene, im Vergleich zu herkömmlichen Klonierungsstrategien sehr effiziente Klonierungstechnik. Nach kurzer Zeit können bis zu 99 % positive Transformanten erhalten werden.

Die Technik beruht auf dem sequenzspezifischen Rekombinationssystem des Phagen λ (einem Bakterienvirus), der mit Hilfe bestimmter Enzyme seine DNA in das Genom des Bakteriums Escherichia coli integriert. Der Integrationsprozess (Lysogenie) wird hierbei von zwei Proteinen katalysiert: der Integrase (Int) des Lambda-Phagen und den E. coli-Untereinheiten IHF a und IHF b (Integration Host Factors). Dieser reversible Vorgang benötigt spezifische Sequenzabschnitte (die attachment sites oder recombination sites - deutsch etwa Verbindungs- oder Rekombinationsstellen) in der Ziel-DNA, zwischen denen die zu übertragenden genetischen Informationen eingefügt werden können. Für ihre Integration sind auch an den Enden dieser zu transferierenden DNA-Abschnitte Verbindungsstellen erforderlich. Für die Exzision (Lyse) des DNA-Fragments wird zusätzlich das Enzym Exzisionase benötigt.

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Durchführung

Die Klonierung besteht im Wesentlichen aus drei Schritten.

1.) Erzeugung eines attB-PCR-Produkts

Um das Gen von Interesse letztendlich erfolgreich exprimieren zu können, muss es zuerst mit den attB-Rekombinationsstellen versehen werden. Diese bestehen aus 25 Basenpaaren und werden von den an der Rekombination beteiligten Enzymen erkannt. Damit im Expressions-Vektor das Gen von Interesse im korrekten Leserahmen angeordnet ist, wurden die Verbindungsstellen für beide Enden des DNA-Abschnitts unterschiedlich konstruiert und zwar so, dass sie nach der Integration in den Donor-Vektor die richtige Orientierung erhalten.

Die Verbindungsstellen können zum Beispiel durch eine PCR mit spezifischen Primern, die am 5’-Ende die attB-Stellen tragen, an das zu exprimierende Gen angefügt werden.

2.) Erzeugung eines Entry Clones

Der zweite Schritt besteht im Austausch des im Donor-Vektor enthaltenen ccdB-Gens gegen das PCR-Produkt. Bei dem ccdB-Gen handelt es sich um ein Selbstmordgen, dessen Genprodukt auf die im Labor normalerweise verwendeten Bakterienstämme toxisch wirkt, und das an seinen beiden Enden die attP-Verbindungsstellen trägt.

Demnach sollten nach erfolgreicher Transformation nur diejenigen Bakterien überlebensfähig sein, bei denen der Austausch des ccdB-Gens gegen das PCR-Produkt erfolgt ist. Zusätzlich tragen die von Invitrogen erhältlichen Donor-Vektoren eine Antibiotka-Resistenz. Diese doppelte Selektion ist ein Grund für die hohe Effektivität dieser Klonierungsmethode. An der zwischen PCR-Produkt und Donor-Vektor erfolgenden BP-Reaktion sind die Enzyme Integrase und IHF a/b beteiligt. Die attB1-site reagiert hierbei spezifisch mit attP1 und attB2 mit attP2, wodurch im entstehenden Entry Clone die attL-Sequenzen generiert werden. Als Bei-Produkt wird das mit den attR-Stellen flankierte Selbstmordgen erhalten.

3.) Erzeugung des Expressions-Vektors

Der dritte Schritt besteht aus der Reaktion zwischen Entry Clone und Ziel-Vektor. Falls eine Genfusion herbeigeführt werden soll, kann der Ziel-Vektor 5’ oder 3’ der attR-Seiten die entsprechende Sequenz tragen. Je nachdem ob im Genprodukt eine N-terminale oder C-terminale Fusion herbeigeführt werden soll. Beispielsweise kann der Ziel-Vektor die Sequenzen für fluoreszierende Proteine tragen wenn durch FRET auf eine Protein-Protein Interaktion getestet werden soll. Außerdem enthält der Ziel-Vektor das von den attR-Stellen flankierte ccdB-Gen. Durch die LR-Reaktion zwischen attL1 und attR1 und zwischen attL2 und attR2 werden im Expressions-Vektor erneut die attB-Seiten generiert. Diese Reaktion entspricht also einer umgekehrten BP-Reaktion, für die zusätzlich das Enzym Exzisionase (Xis) benötigt wird. Um erneut eine doppelte Selektion zu ermöglichen, trägt der Ziel-Vektor eine andere Antibiotika-Resistenz als der Entry Clone. Als Bei-Produkt entsteht bei der LR-Reaktion außer dem Expressions-Vektor ein das Selbstmordgen ccdB tragende Plasmid. Diese Transformanten gehen zu Grunde und nur die gewünschten Transformanten kommen zum Wachstum.