Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle und moderne Form der Lichtmikroskopie.

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Prinzip

Die Funktion eines Fluoreszenzmikroskopes beruht stets auf folgenden Prinzipien:

• Im zu untersuchenden Präparat befinden sich fluoreszierende Stoffe (Fluorochrome) die mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zum Leuchten angeregt werden.
• Die so angeregten Fluorochrome emittieren Licht, welches durch die Stokes-Shift in der Regel langwelliger als das anregende Licht ist (wichtige Ausnahme: sogenannte 2-Photonenanregung mit einem Near-Infrared-(NIR)-fs-Laser).
• Anregungs- und Emissionwellenlänge können im selben Strahlengang optisch getrennt werden und
• die Größe der zu untersuchenden Objekte kann aufgrund ihres Eigenleuchtens bei ausreichend hohem Kontrast weit unter der Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskopes liegen.

  Der Grundaufbau der meisten Fluoreszenzmikroskope entspricht dem eines Auflichtmikroskopes. Das zu beobachtende Objekt wird dabei nicht durchstrahlt, sondern durch das Objektiv beleuchtet. (Die korrekte Bezeichnung lautet daher Epifluoreszenzmikroskop). Als Lichtquellen werden in der Regel Quecksilberdampflampen oder Laser eingesetzt. Quecksilberdampflampen emittieren Licht über das gesamte sichtbare Spektrum sowie im ultravioletten Bereich. Die für die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes notwendige Wellenlänge wird mit optischen Filtern isoliert und das einfarbige Licht auf das Objekt geleitet, worauf dieses zu fluoreszieren beginnt. Das emittierte, in der Regel längerwellige Fluoreszenzlicht wird durch das Objektiv gesammelt. Im Strahlengang befindliche Farbteiler trennen anschließend das Fluoreszenzlicht vom anregenden Licht und leiten es in das Okular des Mikroskopes, auf eine Fotokamera (analog oder digital) oder auf einen elektronischen Verstärker (Photomultiplier).

Anwendungen

In der Biologie werden Fluoreszenzmikroskope vielfältig eingesetzt. Im einfachsten Falle werden Zellbestandteile, die von Natur aus fluoreszieren (Autofluoreszenz) sichtbar gemacht. Dies ist vor allem bei Pflanzen möglich, denn Chlorophylle und andere pflanzliche Pigmente haben die natürliche Eigenschaft, zu fluoreszieren. Im Allgemeinen ist diese Eigenschaft aber unerwünscht, denn unspezifische Autofluoreszenz verschiedener Zellbestandteile führt zu starken Hintergrundsignalen.
Die wichtigsten Anwendungen basieren auf der spezifischen Färbung einzelner Zellbestandteile, meist bestimmter Proteine. Diese werden zuvor entweder mit Hilfe spezifisch bindender fluoreszenzmarkierter Liganden (z.B. Phalloidin-FITC für Aktin, DAPI für DNA), spezifischer Antikörper (Immunfluoreszenz) oder durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP markiert. Aus dem fluoreszenzmikroskopischen Bild können anschließend Rückschlüsse auf die Lokalisation des Proteins in der Zelle gezogen (z.B. im Kern, im Cytoplasma, membrangebunden oder nach außen exportiert) bzw. Zellbestandteile durch ihre spezifischen Proteine visualisiert werden (z.B. Cytoskelett durch Aktin, Mikrotubuli durch Tubulin). Auch Interaktionen von Proteinen untereinander sind beobachtbar. Durch Genexpression eines Markerproteins wie GFP unter Kontrolle eines spezifischen Promotors können auch Zelltypen identifiziert werden, die allein aufgrund ihres lichtmikroskopischen Erscheinungsbild nicht sicher angesprochen werden können. Je nach angewandter Methode ist auch die Verfolgung einzelner Vorgänge in lebenden Zellen möglich.

Heute existiert eine breite Palette an Fluoreszenzmarkern, Markierungsmethoden und Mikroskopietechniken.

Spezielle Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie

Konfokalmikroskopie

Bei der Konfokalmikroskopie, wie auch bei ihrer speziellen Form der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (CLSM), gelangt durch den Einsatz einer Lochblende nur Fluoreszenzlicht eines winzigen Teiles der angeregten Probe in das Mikroskop. Das Volumen, aus dem die Fluoreszenz dann ausgelesen wird, wird so auf weniger als ein Femtoliter (0,000 000 000 000 001 Liter) beschränkt. Dies hat den entscheidenden Vorteil, dass Hintergrundsignale ebenfalls fluoreszierender Bestandteile aus höher oder tiefer liegenden Schichten des Präparates ausgeblendet werden können. Auf diese Weise ist Mikroskopieren in mehrschichtigen Präparaten, zum Beispiel in ganzen Blättern oder tierischen Embryos, möglich. Durch Scannen übereinander liegender Schichten und anschließende Rekonstruktion der so gewonnenen Einzelbilder können außerdem dreidimensionale Bilder erstellt werden.

2-Photonen-Mikroskopie

Bei der 2-Photonen-Mikroskopie (siehe auch Multiphotonen-Mikroskopie) wird der Effekt ausgenutzt, dass die Fluoreszenzanregung statt durch Absorption eines energiereichen Photons auch durch die zeitgleiche Absorption zweier energieärmerer Photonen erfolgen kann, d.h. dass statt kurzwelligem Licht (z.B. 375 nm), längerwelliges Licht (z.B. 750 nm) zur Anregung genutzt werden kann. Der 2-Photoneneffekt bedarf einer hohen Photonenflussdichte, wie sie nur im Zentrum eines gepulsten Laserstrahles existiert, d.h. nur in diesem Bereich wird die Probe zur Fluoreszenz angeregt. Im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie, wo das Auslesevolumen beschränkt ist, ist hier das Anregungsvolumen limitiert, was zu einer wesentlich schonenderen Behandlung der oft empfindlichen biologischen Proben führt. Zudem hat längerwelliges Laserlicht eine höhere Eindringtiefe in biologische Proben, z.B. Geweben, und führt zu weniger chemischen Bindungsbrüchen als z.B. kurzwelliges Laserlicht (UV). Durch die so etwa verdoppelte Wellenlänge des anregenden Lichtes kommt es hier zu dem scheinbaren Paradoxon, dass die Fluoreszenz kurzwelliger ist als die sie verursachende Anregung. Typische Anregungsquellen sind gepumpte Titan-Saphir-Laser, die im 90 bis 120 fs-Bereich pulsen, und von etwa 750 nm bis 1100 nm durchstimmbar sind (Nahes Infrarot- NIR)

STED-Mikroskopie

Bei der STED-Mikroskopie (STED steht für Stimulated Emission Depletion) wird eine Auflösung bis zu 50 nm erreicht. Die Anregung erfolgt durch Kombination von UV-Licht mit einem nachfolgenden roten Lichtstrahl. Dabei fallen die angeregten Moleküle an den Rändern wieder in den Normalzustand zurück. Für biologische Systeme ist dieses Verfahren allerdings noch nicht ausgereift, da der Energieeintrag in die Probe zu groß ist.