Chemismus der Dipeptidylpeptidase IV

Das Enzym Dipeptidylpeptidase IV wurde erstmals 1964/66 von Hopsu-Havu beschrieben ^[1]. Erst im Laufe der Zeit wurde erkannt, dass dieses Enzym wesentliche Funktionen im menschlichen und tierischen Organismus ausübt.
Nach der Nahrungsaufnahme werden im Magen verschiedene Hormone freigesetzt, sogenannte Inkretine, die die Freisetzung von Insulin im Körper steigern. Die DP IV spaltet diese Inkretine und stoppt somit deren Wirkung. Man schließt daraus, dass Inhibitoren der DP IV potentielle Medikamente gegen Diabetes mellitus Typ II sind, da eine vermehrte Freisetzung von Insulin helfen könnte, den chronisch erhöhten Blutzucker zu senken^[2]. Gegen Diabetes mellitus Typ I würde eine Hemmung dieses Enzyms nichts bewirken: Hier kann überhaupt kein Insulin mehr produziert werden, da die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse vollkommen zerstört sind. (Anmerkung: Das Enzym Dipeptidylpeptidase IV wird im internationalen Schrifttum gleichbedeutend als DPP IV oder DP IV bezeichnet. In vorliegender Arbeit wird die Bezeichnung DP IV [Dipeptidyl Peptidase IV] bevorzugt).

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Der Funktionsmechanismus aus chemischer Sicht (Chemismus)

Das Enzym DP IV kommt ubiquitär im menschlichen, aber auch im tierischen Organismus vor. Es ist eine Proteinase, die vom N-terminalen Ende eines Peptids Zweiergruppen von Aminosäuren (Dipeptide) abspaltet. Da sich im Aktiven Zentrum des Enzyms die Aminosäure Serin befindet, gehört es zu den Serinproteinasen. Es kann nur vom Aminogruppen (N)-Ende eines Peptids Dipeptide abspalten, nicht jedoch vom Carboxylgruppen (C)-Ende (siehe Peptidbindung).
Ein beispielhaftes Peptid als Substrat für die DP IV sieht folgendermaßen aus, wobei Xaa2, Xaa1 und X'aa1 für beliebige Aminosäuren stehen und der senkrechte Strich für die Stelle, an der das Enzym die Peptidbindung spaltet. Mit P2, P1 und P'1 werden die Positionen der Aminosäuren relativ zur Spaltungsstelle beschrieben:

N-Xaa2-Xaa1-|-X'aa1-...
   P2   P1   P'1 

N-Xaa2-Xaa1-C  +  N-X'aa1-...

Die DP IV spaltet bevorzugt Peptide, wenn sich ein Prolinrest in P1-Position befindet^[3].

Die Substratspezifität in P1-Position (Xaa1)

Neben Peptiden mit Prolin in P1-Stellung, spaltet die DP IV auch noch Peptide mit anderen Aminosäuren in dieser Position^[4][5].

Zunächst wurde festgestellt, dass neben Prolin- auch Hydroxyprolin- und Dehydroprolinreste sehr gut akzeptiert werden. Auch Substrate mit Pipecolinsäureresten in P1-Stellung sind ähnlich aktiv. Im Schema 1 wird ein „Prolinstammbaum“ vorgestellt, der auf direktem Wege vom Prolin bis zum Glycin führt. Wie verhalten sich nun die einzelnen Dipeptid-pNA, wenn in P1-Stellung Prolin durch die angeführten Aminoacylreste des „Stammbaums“ ausgetauscht wird ? Es konnte gezeigt werden, dass alle diese Derivate mehr oder weniger aktive Substrate darstellen. Erfolgreich geprüft wurden in Ala-Xaa1-pNA besonders Xaa1 = Thz, Oxa, Pip und Aze.

Ferner wurden geprüft die Xaa1-Reste von: Gly, Abu, Nva, Sar, N-Ethyl-Gly, N-(nPropyl)-Gly, N-Methyl-Abu, N-Methyl-Ala und N-Ethyl-Ala. Interessant ist, dass es im Hinblick auf die Wirksamkeit der DP IV Substrate eine Abstufung in folgender Richtung gibt:

                                Prolin > Alanin > Glycin.

Hinsichtlich des kcat/KM-Wertes ist das Aze-Derivat vergleichbar mit dem entsprechenden Pro-Substrat. In dem einen Fall handelt es sich um einen Fünf- im anderen Fall um einen Vierring. Ebenfalls interessant war die Prüfung der Verbindungen Ala-Xaa1-pNA mit Xaa1 = a-5MeOxa, und s-5MeOxa. Ala-(s-5MeOxa)-pNA fungierte als Substrat, Ala-(a-5MeOxa)-pNA nicht [s = syn, a = anti]. Der Prolinring ist nicht planar gebaut, sondern liegt in einer Konfiguration analog dem Schema 2 (links) vor.

Demzufolge sind auch die Positionen im Ringsystem des Prolins unterschiedlich zu bewerten. Daraus erklärt sich, warum Xaa2-Hyp-pNA ein Substrat ist, Xaa2-(a-5MeOxa)-pNA aber mittels DP IV nicht enzymatisch hydrolysiert wird.

Es wird beobachtet, dass in Substraten vom Typ Xaa2-Pro-X’aa1 die Spaltungsrate von der Natur des Restes X’aa1 abhängt. Offensichtlich verschiebt sich in diesem Falle der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (siehe unten) von der Deacylierung (k3) in vorangehende Schritte. Denkbar ist eine Behinderung des Einstroms dieser Substrate in das aktive Zentrum der DP IV. Der langsamste Schritt sollte hier möglicherweise vor dem eigentlichen katalytischen Prozess liegen. Hier ist im einfachsten Fall (bei Annahme von ka sehr viel kleiner als k3 und k3 sehr viel kleiner als k2 und k1)

                      kcat = k3ka      und            KM = k-ak3/kak1

ka = Geschwindigkeitskonstante des Einstroms des Substrates in das aktive Zentrum, k-a = Geschwindigkeitskonstante des Ausstroms des Substrates aus dem aktiven Zentrum, k1 = Geschwindigkeitskonstante tetraedrischen Intermediats, k2 = Geschwindigkeitskonstante des Acylierungsschrittes (TI1 ® Acylenzym), k3 = Geschwindigkeitskonstante des Deacylierungsschrittes (TI2 ® Dipeptid).

Die Substratspezifität in P2-Position (Xaa2)

Auch wurde die Bedeutung des N-terminalen Aminosäurerestes in P2-Stellung (Xaa2) eruiert. Untersucht wurden u.a. in Xaa2-Pro-pNA die Reste von : Pro, Abu, Leu, Val, Ala, Ile, Glu, Phe, Tyr, Ser, Gln, Lys, Asp, Asn sowie N,N-Dimethyl-Glycin [(N,N)-DMG], N,N,N-Trimethyl-Glycin [(N,N,N)-TMG] und S,S-Dimethyl-sulfonium-essigsäure [(S,S)-DMS]. Alle Substanzen fungierten als Substrate der DP IV (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1

Wie weit entfernt kann die N-terminale Aminofunktion von der Peptidbindung zwischen P1 und P2 sein ? Dazu wurden in Xaa2-Pro-pNA Aminosäurereste von Ala, β-Ala, γ-Abu und ε-Ahx verwendet. Die Derivate von Ala, β-Ala und γ-Abu sind Substrate der DP IV mit fallender Tendenz. Die ε-Ahx Verbindung wird nicht hydrolysiert.

Tabelle 2

Die Rolle der Aminoacylreste in P’1-Position (X’aa1)

Um die Bedeutung der Aminoacylreste in P’1-Position zu klären wurden kinetische Studien mit den Tripeptiden Ala-Pro-X’aa1 durchgeführt. Überraschenderweise zeigt sich, dass keine enzymatische Hydrolyse stattfindet, wenn X’aa1 = Pro-, Hyp-, Dehydroprolyl-, Pipecolyl-, Aciridyl-Reste sind oder allgemein die zu spaltende Peptidbindung –CO-NH- durch –CO-N(R)- ersetzt ist (R ungleich H).

Die „Erkennungsstruktur“ der Substrate der DP IV

Auf Grund des umfangreichen kinetischen Datenmaterials wurden intensive Studien der Computersimulation durchgeführt. Ein Resultat dieser Bemühungen war die Formulierung einer Struktur, die alle Substrate besitzen müssen, um im aktiven Zentrum der DP IV als Substrate erkannt zu werden. Diese „Erkennungsstruktur“ ist in der Abbildung 1 gezeigt.

Von Bedeutung ist die interne H-Brücke. Jede Behinderung ihrer Ausbildung führt zur Inaktivität als Substrat. Die Tatsache, dass jede Substitution an der NH-Gruppe der zu spaltenden Peptidbindung diese verhindert, ist der Grund, warum alle Peptide die das Strukturmerkmal –CO-N(R)- mit R ungleich H haben einer enzymatischen Hydrolyse nicht zugänglich sind. Es ist zu erwarten dass die interne H-Brücke verhindert wird durch:

a) eine cis-Peptidbindung und b) den optischen Antipoden

Es ist bekannt, dass Prolinpeptide über eine messbare cis-Konfiguration an der zu spaltenden Peptidbindung verfügen. Wir haben das Verhältnis von trans- zu cis-Bindung am Beispiel des Substrates Ala-Pro-pNA ermittelt und die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe der schnellen Kinetik (stopped flow Messungen) verfolgt. Es zeigt sich ein biphasischer Umsatz nach der Zeit. In der ersten Phase kann ein schneller von der Enzymkonzentration abhängiger Abbau bis zu dem Prozentsatz, der für das Vorhandensein der trans-Peptidbindung gefunden wurde, beobachtet werden, danach erfolgt ein langsamer Reaktionsverlauf, der bestimmt wird, von der Enzym-unabhängigen cis-trans-Umwandlungsgeschwindigkeit. Demnach erfolgt erwartungsgemäß eine Spaltung nur über die trans-Bindung, die cis-Bindung ist inaktiv.

Die Stereospezifität

Ferner sind die Substrate in P1-Position absolut stereospezifisch. Ala-L-Pro-pNA z.B. ist ein gutes Substrat, Ala-D-Pro-pNA wird enzymatisch nicht hydrolysiert. Bei Verbindungen vom Typ D-Xaa2-Pro-pNA findet ebenfalls keine Hydrolyse statt. D-Xaa2-Ala-pNA aber sind Substrate der DP IV. Tabelle 3 demonstriert dies am Beispiel des Ala-Ala-pNA, D-Ala-Ala.pNA und Aib-Ala-pNA. Das Phänomen, dass D-Phe-Pro-pNA und D-Tyr-Pro-pNA unkompetitive Inhibitoren der Hydrolyse von Ala-Pro-pNA sind (die Ki-Werte sind: 0,35 ± 0,04 mM und 0,52 ± 0,04 mM), wonach beide Inhibitoren keine kompetitive oder gemischte Hemmer sind, und bei Ala-Ala-pNA als Substrat die Verbindungen keinen inhibitorischen Effekt zeigen, ist im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit diskutierten theoretischen Schlussfolgerungen zu sehen.

Tabelle 3

Auffallend ist, dass die Stereoselektivität in P2, wie die Tabelle 3 zeigt, sich nicht auf den KM-Wert, wohl aber gravierend auf die kcat-Werte aufwirkt. Auf diesen Effekt, der überraschend ist, soll weiter unten eingegangen werden.

Die Sequenz der Enzymkatalyse

Es wird angenommen, dass im Verlaufe der Enzymkatalyse die Reaktionsfolge, dargestellt in Schena 3, durchlaufen wird :

Danach ist zwischen einem Acylierungsprozess und einem Deacylierungprozess zu unterscheiden. Das Substrat dringt in das aktive Zentrum ein (siehe Erkennungskomplex) und es bildet sich ES. Daraus folgt das tetraedrische Intermediat des Acylierungsprozesses TI1. Nach Abspaltung des ersten Spaltproduktes entsteht durch Anlagerung eines Wassermoleküls das zweite tetraedrische Intermediat TI2 (Deacylierungsprozess). Nach Spaltung von diesen wird letztendlich das freie Enzym und das zweite Spaltprodukt (Dipeptid) freigesetzt. Das erste tetraedrische Intermediat TI1 ist asymmetrisch. Theoretisch kann sich hier eine S- und/oder eine R-Form ausbilden. TI2 ist dagegen symmetrisch. Hier entstehen keine antipodischen Strukturen.

Zunächst erhebt sich die Frage, wo bei den Substraten der geschwindigkeitsbestimmende Schritt lokalisiert ist, ob im Bereich der Acylierung oder der Deacylierung. Es wurden daher Untersuchungen mit den Substraten Ala-Ala-anilid und Ala-Pro-Anilid mit verschieden substituierten Arylringen im pH-Optimum durchgeführt. Der Hansch-Approach (QSWA = Quantitative-Struktur-Wirkungs-Analyse) brachte keine Korrelaton bei den substituierten Derivaten der Reihe Ala-Pro-Anilid, wohl aber eine solche in der Reihe Ala-Ala-Anilid.

                      Substrat : Ala-Ala-NH-C6H4-R
                      QSWA     : lgkcat = 0,807s +- 0,186
                      R        : -H, p-F, p-Cl, p-Br, p-CH3, p-OCH3, p-OC2H5, p-NO2, m-Cl
                                 m-CH3, m-CF3, m-NO2 

                      Substrat : Ala-Pro-NH-C6H4-R
                      QSWA    : keine Korrelation

Daraus geht hervor, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Alaninreihe in der Acylierung liegt, in einem Bereich also, wo die substituierten Aniline noch nicht abgespalten sind (k2). In der Prolinreihe dagegen sollte der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Deacylierung liegen (k3). Die Messungen wurden beim pH-Optimum (siehe unten) durchgeführt.

Die Frage ist nun : lässt sich die Konformation des tetraedrischen Intermediats TI1 ermitteln ? Zu diesem Zwecke wurde eine QCAR Analyse (Quantitative Conformation Activity Relationships) in der Alaninreihe durchgeführt. Die Resultate lassen vermuten, dass die Effekte dann auftreten, wenn der –NH-Ar-Rest aus dem tetraedrischen Intermediat TI1 austritt (k2). Aus der QCAR-Analyse folgt nämlich eine mögliche Konformation mit einer „Behinderung“ der Wasserstoffatome a und b, die, entsprechend der Struktur in Schema 4 bei der Rotation des aromatischen Ringes auftritt.

Das Schema 5 demonstriert die beiden Antipoden des TI1. Nur die Form links führt zur sterischen Hinderung der oben genannten Wasserstoffatome, nicht aber die rechts dargestellte Struktur. Dies könnte ein Hinweis auf die Stereospezifität des tetraedrischen Intermediates TI1 sein (im Zusammenhang mit den Ergebnissen der D-Isotopemessungen – siehe unten).

Die Untersuchungen zur pH-Wert Abhängigkeit, demonstriert an der DP IV aus Schweinenierenrinde, ergab ein pH-Optimum von ca. 6,7. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 30 Grad C. Die Studien ergaben ferner, dass für die Aktivität der Substrate eine positive Ladung am N-Terminus nötig ist. Dabei ist die Protonisierung der N-terminalen primären Aminogruppe notwendig. Sie ist aber keine Bedingung. Für die Substraterekennung ist die Existenz einer positiven Ladung genügend, wie aus der Tabelle 1 hervorgeht. Streng genommen handelt es sich bei der DP IV also nicht um eine Aminopeptidase, sondern um eine Oniumacylaminoacyl Peptidase. Die katalytische Abspaltung von Dipeptiden aus einem Oligo- oder Polypeptid vom N-terminalen Ende ist aber, physiologisch gesehen, ein essentieller Prozess. Dennoch sollte die Bezeichnung DAP IV nach Möglichkeit zugunsten der Kennzeichnung DPP IV, besser DP IV, vermieden werden.

Sekundäre D-Isotopieeffekte und Solventisotopieeffekte in D2O

Im Schema 4 und Schema 5 (links) ist ein mögliches Modell des TI1 dargestellt. Seine Bestätigung sollte durch D-Isotopieeffekte möglich sein, wenn einerseits ein H/D-Austausch im Asymmetriezentrum der P1 Aminosäure erfolgt und andererseits ein H/D-Austausch im aromatischen Ring in o-Stellung erfolgt. Es zeigt sich, dass in beiden Fällen sekundäre D-Isotopieeffekte zu messen sind. Bei Ala-Ala-pNA (L-Ala-L-Ala-d1-pNA) sind im pH-Optimum bei Zimmertemperatur sekundäre D-Isotopieeffekte messbar. Sie betragen in kcat = 1,27 und in KM = 1,24. Wird das Substrat im aromatischen Ring vollständig deuteriert (Ala-Ala-NH-C6D4-pNO2), so ergeben sich sekundäre D-Isotopieeffekte in kcat und in KM von 1,05 ± 0,03. Interessant ist, dass ein sekundärer D-Isotopieeffekt in kcat/KM, entsprechend dem Schema 6 in Abhängigkeit vom pH-Wert auftritt. Der Kurvenverlauf ist bemerkenswert. Bei fallenden pH-Werten von etwa 7,5 bis etwa 5,0 ist kein Isotopieeffekt messbar. Ab pH 5.0 beobachtet man einen steigenden sekundären D-Isotopieeffekt mit fallendem pH-Wert, verbunden mit einem Übergang von k3 nach k2 als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt.

Dieses Resultat unterstreicht die hohe Wahrscheinlichkeit der in dem Schema 4 dargestellten Struktur.

Messungen der Solvent-D-Isotopieeffekt ergeben im Falle der Substrate Ala-Pro-pNA und Gly-Pro-pNA mit dem in der Deacylierung liegenden geschwindigkeitbestimmenden Schritt einen Ein-Protonen-Übergang und beim Ala-Ala-pNA, der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Acylierung liegend, einen Zwei-Protonen-Übergang (Tabelle 4).

Tabelle 4

Inhibitoren

Es wurden eine Reihe von Dipeptiden auf ihre Wirkung als (kompetitive) Inhibitoren der DP IV untersucht. Die Tabelle 5 zeigt eine Übersicht.

Tabelle 5

Von diesen Dipeptiden, die auch Spaltprodukte DP IV-Katalyse sind, ist das Ile-Pro mit einem Ki-Wert von etwa 7,0 x 10-6 [M] und das ε-Z(4-NO2)Lys-Pro (Ki etwa 10-6) interessant. Um etwa eine Größenordnung wirksamer sind die entsprechenden Pyrrolidide (Tabelle 6)

Tabelle 6

Röntgenkristallstruktur der Dipeptidylpeptidase IV

Gegenwärtig sind intensive Studien auf den Gebiet der Röntgenkristallstrukturanalyse der DP IV im Gange. Das Enzym besteht in der Regel aus zwei identischen Untereinheiten. Jede dieser Untereinheiten besitzt eine N-terminale Peptidsequenz, die das Protein an der Oberfläche einer Zelle verankert. Es wurden auch höhere Aggregate bei der löslichen DP IV gefunden, bestehend aus vier identischen Untereinheiten.

Für bestimmte Aussagen ist eine nicht so in das Detail gehende Darstellung der Conolli-Oberfläche günstiger. Hier zeigt sich, dass die DP IV eine ungewöhnliche Oberflächenstruktur besitzt. Das aktive Zentrum befindet sich nicht an der Oberfläche außen, sondern in Innern des Proteins. Der Zugang zu dem aktiven Zentrum ist durch einen „Schlauch“ möglich, der eine größere und eine kleinere Öffnung besitzt. Die Frage ist, wie und vor allem wo erfolgt z.B. der Substrateintritt ? Die Abbildung 2 zeigt diese Struktur, wie sie von der Gruppe um Reutter veröffentlicht wurde.

Wenn man sich das elektrostatische Potential an der Oberfläche ansieht, so stellt man fest, dass in der Nähe und innerhalb der großen Öffnung ein sehr starkes negatives Potential mit einem Gradienten in Richtung der Öffnung vorhanden ist (Abbildung 3). Die kleinere Öffnung hat demgegenüber kein so starkes negatives Potential. Es ist daher denkbar, dass die Substrate mit dem positiv geladenen N-Terminus der das Potential größerer Bereiche der Erkennungsstruktur der Substrate prägt in diese Öffnung „hineingezogen“ werden. (Darstellung einer Untereinheit, humane DP IV).

Die Struktur des tetraedrischen Intermediats TI1

Aus dem experimentellen Befund, wonach das als Substrat fungierende D-Ala-Ala-pNA über kcat wirkt, wobei KM gegenüber dem des Substrates Ala-Ala-pNA unbeeinflusst bleibt (siehe Tabelle 3), drängt sich die Deutung auf, dass der N-terminale Aminoacylrest (wahrscheinlich mit der positiven Ladung) direkt mit dem tetraedrischen Intermediat in P1-Position in Wechselwirkung tritt. Daher wurde eine hypothetische Konformation wie folgt konstruiert (Schema 7).

Der Unterschied zwischen den Substraten die Prolin- und der Alaninreihe besteht darin, dass die Bindung A-B im Falle der Alaninreihe etwas drehbar ist. Die damit verbundenen Reste können sich im begrenzten Maße an räumliche Bedingungen des Enzymproteins anpassen. Im ersteren Fall (Prolinreihe) ist diese Bindung nicht flexibel.

Es scheint zwei Typen von Wasserstoffbrücken zu geben, nämlich solchen, die für die direkte Bindung im aktiven Zentrum verantwortlich sind, d.h. das Substrat oder den Inhibitor an die wechselwirkungsaktiven Reste des Proteins heranführen und solchen, die direkter Bestandteil des Funktionsmechanismus sind. Wenn im Laufe des Funktionsmechanismus der Serinproteasen tetraedrische Intermediate TI1 und TI2 (siehe Schema 3) entstehen, ist TI1 asymmetrisch. Beim Aufrichten des Carbonylatoms der zu spaltenden Peptidbindung können sich zwei antipodische Konformationen ausbilden, von der eine das Peptid als Substrat (1), die andere als Inhibitor (2) erkennen sollte (Schema 5) Die Entscheidung, in welcher Richtung sich die Carbonylgruppe aufrichtet, d.h. welches der antipodischen tetraedrischen Intermediate bevorzugt entsteht, wird davon abhängen, in welcher Richtung die Wechselwirkungen der Proteinseitenketten im aktiven Zentrum (z.B. H-Brücken) am wirkungsvollsten sind bzw. die räumliche Anpassung des Effektormoleküls am effektivsten erfolgt. So ist es durchaus möglich, dass ein Inhibitormolekül auch Substrat sein kann. Eine entscheidende Triebkraft der Abtrennung eines Molekülteils aus dem tetraedrischen Intermediat ist, ob das Prinzip der stereoelektronischen Kontrolle nach Delonghchamps gültig ist. Es besagt, dass die Spaltung von Estern oder Amiden über ein tetraedrisches Intermediat nur erfolgen kann, wenn beide am zentralen sp3-Kohlenstoffatom verbleibende Heteroatome eines ihrer einsamen Elektronenpaare jeweils antiperiplanar zur spaltenden Bindung ausrichten.

Die Röntgenstrukturanalyse des DP IV/Pro-Pro-boronsäurekomplexes bestätigt in eindrucksvoller Weise die im Schema 7 angenommene Struktur (Abbildung 4). Von Interesse ist, dass der Boronsäurekomplex tatsächlich eine tetraedrische Struktur ausbildet, dass eine Wechselwirkung einerseits mit dem Tyr547 des Proteins und einem O-Atom des TI (Abstand = 2,04 A) stattfindet und dass andererseits zwischen dem Asn710 des Proteins und dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung eine Wechselwirkung erfolgt (Abstand = 1,93 A). Letztere H-Brücke ist sinnvoll. Sie fördert die Aufrichtung der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung im oben gezeigten Sinne (vergl. Schema 7). Diese Verhältnisse sind in dem Ausschnitt aus der Röntgenkristallstruktur des DP IV/Boronsäure-Komplexes (Abbildung 4) ersichtlich.

Ähnliche Bilder zeigen die durch Diprotin A (Abbildung 5 – rechts) und tertBuGly-Pro-Ile (Abbildung 5 – links) erzeugten Strukturen. Hier entstehen asymmetrische tetraedrische Konformationen. Sie stellen sich als antipodisch gegenüber der in dem Schema 7 angenommenen Struktur dar. Sollten diese durch die Röntgenstruktur ermittelten realen antipodischen Strukturen charakteristisch für Transition-State-Inhibitoren sein ? Durch diese hypothetische Annahme ließe sich erklären, warum die Verbindungen

                         Diprotin A (Ile-Pro-Ile)
                         Diprotin B (Val-Pro-Leu)     und
                         TertBuGly-Pro-Ile,

die grundsätzlich eine Substratstruktur besitzen, Inhibitoren sind. Der Begriff „hypothetisch“ bringt zum Ausdruck, dass die hier gezeigten Röntgenstrukturen (Abbildung 5) die Konformationen von Inhibitoren darstellen, die Konformationen der TI (TI1) von Substraten können unter den experimentellen Bedingungen der Röntgenkristallstruktruranalyse nicht dargestellt werden.

Die Frage: Sind Diprotin A oder Diprotin B Substrate oder Inhibitoren der DP IV ? – wurde im Jahre 1991 von Rahfeld et al. gestellt. Umezawa et al. berichten, dass beide Diprotine als Inhibitoren der DP IV wirken. Rahfeld stelle fest, dass sowohl Ile-Pro-Ile als auch Val-Pro-Leu erwartungsgemäß Substrate der DP IV sind. Die Autoren sprechen von der Inhibitorwirkung als einem „kinetischen Artifakt“ Die Röntgenkristallstruktur-Studien belegen die Konformation in TI1, die dem Inhibitormolekül zugeordnet werden sollte, denn die Substratstruktur ist mit Sicherheit unter den Kristallisationsbedingungen nicht erfassbar. Um so erstaunlicher ist, dass die Diprotine im wässriger Milieu (kinetische Messungen) nach längerer Zeit (nach ca. 20,5 Stunden unter den in der Literatur angegebenen Bedingungen) vollständig hydrolysiert werden. Offensichtlich stellt sich ein Gleichgewicht der antipodischen TI-Konformationen in verdünnter wässriger Lösung allmählich immer wieder neu ein. Über einen solchen Mechanismus wird der Dualismus bei den Diprotinen klar. Ihre Ki- und KM-Werte sind in der Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Natürliche Substrate der Dipeptidylpeptidase IV

(siehe Dipeptidyl Peptidase IV)

Zusammenfassung

Die aufgrund der experimentellen Ergebnisse getroffenen theoretischen Ableitungen beantworten unter anderem folgende Fragen:

1. Warum ist bei den Substraten der DP IV ein positiver N-Terminus insbesondere z.B. eine protonisierte N-terminale Aminogruppe nötig. Warum sind N,N,N-Trimethylammoniumacetyl-Pro-pNA, Pyridimiumacetyl-Pro-pNA oder S,S-Dimethylsulfoniumacetyl-Pro-pNA Substrate der DP IV ?
2. Warum werden Peptide enzymatisch nicht hydrolysiert, wenn sich in P’1-Position z.B. ein Prolylrest befindet, bzw. allgemein die entsprechende Peptidbindung zwischen der P1- und P’1-Position die Struktur –CO-N(R)- hat (R ungleich H) ?
3. Warum sind alle Peptide, die in P1-Position einen Aminoacylrest enthalten der sich vom „Prolinstammbaum“ ableitet, mehr oder weniger Substrate der DP IV ?
4. Warum werden bei der enzymatischen Hydrolyse durch DP IV von einem als Substrat funktionsfähigen Peptid spezifisch Dipeptide abgespalten ?
5. Warum ist z.B. D-Ala-Ala-pNA ein Substrat der DP IV, D-Ala-Pro-pNA aber nicht ?
6. Warum ist z.B. Ala-(syn-5MeOxa)-pNA ein Substrat der DP IV, Ala-(anti-5MeOxa)-pNA nicht und warum ist Xaa-Hyp-pNA ein Substrat und Xaa-(anti-5MeOxa)-pNA keines ?
7. Warum ist in spaltfähigen Tripeptiden (freier C-Terminus) der „Prolinreihe“ der geschwindigkeitsbestimmende Schritt von der Natur des C-terminalen Aminoacylrestes abhängig ?
8. Warum inhibiert unter Standardbedingungen PMSF die Serinprotease DP IV nicht ?
9. Warum sind Aminoacyl-Pyrolidide, -Oxazolidide oder –Thiazolidide bessere Inhibitoren der DP IV als die entsprechenden Xaa-Pro, Xaa-Oxa oder Xaa-Thz Dipeptide ?
10. Warum sind z.B. Boronsäuren Tranition-State-Inhibitoren der Serinproteasen (DP IV) ?
11. Wie erklärt sich der „Dualismus“ Substrat/Inhibitor z.B. bei den Diprotinen ?

Abschließende Bemerkungen

Die Dipeptidylpeptidase IV ist physiologisch und pharmakologisch von großem Interesse. Einige aktive und spezifische Inhibitoren des Enzyms wurden als potentielle Wirkstoffe gegen Diabetes mellitus Typ II erkannt. Es gibt Vermutungen, dass DP IV oder verwandte Enzyme eine Rolle bei Prozessen der Wundheilung, in der Pathogenese von AIDS und möglicherweise in einer Reihe von Krebsarten spielen. Intensive immunologische Studien sind gegenwärtig im Gange.

Schon vor einigen Jahren wurde die enge Verwandtschaft der Enzyme DP II und PSE (Prolin spezifische Endopeptidase), auch PPCE (Post Proline Cleaving Enzyme) genannt, zur DP IV beschrieben. In neuerer Zeit wurde gefunden, dass die DP IV Mitglied einer Familie von Dipeptidyl-Peptidasen ist. Es ist zu vermuten, dass auf diesem Gebiet durch vergleichende mechanistische und physiologische Studien noch weitere Einsichten in theoretische und angewandte Fragestellungen resultieren werden.

Einzelnachweise

1. ↑ Hopsu-Havu und Glenner, Histochem. 7, 197, 1964
2. ↑ [http://www.glucagon.com/DPP-IV%20Review%20Expert%20Opinion%202003.pdf Daniel J Drucker: Therapeutic potential of dipeptidyl peptidase IV inhibitors for the treatment of type 2 diabetes]
3. ↑ Eintrag in der Enzyme Nomenclature des NC-IUBMB
4. ↑ Heins J et al.:Mechanism of proline-specific proteinases: (I) Substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney and proline-specific endopeptidase from Flavobacterium meningosepticum. Biochim Biophys Acta. 1988 May 18;954(2):161-9. PMID: 2896517
5. ↑ Rahfeld J et al.:Extended investigation of the substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney. Biol Chem Hoppe Seyler. 1991 May;372(5):313-8. PMID: 1678608

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