Bunte Reihe (Labor)

Bei der sogenannten Bunten Reihe handelt es sich um eine labortechnische Methode zur Identifizierung von Bakterien. Die älteste und kompakteste Version ist die „kleine Bunte Reihe“. Die Identifizierung erfolgt durch den Nachweis bestimmter Enzymaktivitäten, den Abbau von Substraten und den Nachweis bestimmter Fähigkeiten (Beweglichkeit). Die traditionelle kleine Bunte Reihe (Identifizierung von Darmbakterien) enthält: Kligler-Agar, Harnstoff-Röhrchen, MIO-Röhrchen, Simmons Citrat-Agar.

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Überblick

Die Bunte Reihe besteht aus Reagenzröhrchen, die mit verschiedenen Nährmedien beschickt sind. Die Nährmedien enthalten Reagenzien und Indikatoren zum Nachweis von bestimmten Eigenschaften, die eine Identifizierung von Bakterienspezies ermöglichen. Beimpft werden die Röhrchen mit einer Reinkultur des zu identifizierenden Bakteriums. Zuerst wird senkrecht in den Agar gestochen und danach auf der Schrägfläche im Zickzackkurs ausgestrichen. Da das Agargel im MIO-Röhrchen weniger Agarose enthält, um den Bakterien das Schwimmen in dem Gel zu ermöglichen, ist das Gel so weich, dass keine Schrägfläche gebildet werden kann. Anschließend wird zur Reinheitskontrolle auf einem MacConkey-Agar ausgestrichen (die Kolonien müssen wie die zur Beimpfung der Bunten Reihe verwendete aussehen und es dürfen keine anderen auf dem Agar wachsen). Zum Indolnachweis wird nach der Ablesung des MIO-Röhrchens Ehrlich-Reagenz auf den Agar getropft.

Die Ergebnisse (positiv/negativ) werden mit einer Tabelle verglichen und so kann man mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit den Bakterienstamm einer Spezies zuordnen. In den meisten Fällen sind so die häufigsten Darmbakterien schnell zu identifizieren, jedoch gibt es Ausnahmen und Unregelmäßigkeiten. Genauer ist die Untersuchung mittels eines Systems, bei dem 20 bis 30 biochemische Untersuchungen innerhalb von 24 Stunden durchgeführt und visuell oder elektronisch ausgewertet werden können (zum Beispiel Analytical Profile Index API).

Einzelne Tests

Kligler-Agar

• Nachweis von:
  • Laktase (laktosespaltendes Enzym)
  • Gärung, erkennbar durch Gasbildung (CO₂)
  • H₂S-Bildung

• Zusammensetzung:
  • 1 % Laktose (Substrat)
  • 0,1 % Glucose (Substrat)
  • Phenolrot (pH-Indikator)
  • Eisenammoniumcitrat (Reagenz)

• Reaktionen:
  • Durch den Glucoseabbau entsteht Säure und bei pH < 7 wird Phenolrot gelb. Nach Oxidation der Säuren an der Schrägfläche in Gegenwart von Luftsauerstoff wird der Agar im oberen Bereich realkalisiert (der pH-Wert steigt über 7) und dieser Teil des Agars wird rot, es sei denn, auch Laktose wird gespalten, wodurch zusätzliche Säure gebildet wird, dann bleibt der gesamte Agar durch die größere Säuremenge gelb.
  • Geschieht dies ohne Verwendung von Sauerstoff (Gärung), so bildet sich CO₂, das als kleine bis große Gasblasen und Risse im Agar sichtbar wird.
  • Gebildetes H₂S reagiert mit dem Eisenammoniumzitrat zu Eisensulfid, das als schwarzer Niederschlag ausfällt.

• Ergebnisse:
  • gesamter Agar gelb: Laktase-Aktivität positiv
  • Agar gelb und Schrägfläche rot: Laktase-Aktivität negativ
  • Gasblasen: CO₂-Bildung positiv
  • Schwarzfärbung: H₂S-Bildung positiv

Harnstoff-Röhrchen

• Nachweis von:
  • Urease (harnstoffspaltendes Enzym)

• Zusammensetzung:
  • Harnstoff (Substrat)
  • Phenolrot (pH-Indikator)

• Reaktionen:
  • Wird der Harnstoff durch das Enzym Urease abgebaut, so entsteht ein alkalisches Milieu durch Ammoniak-Bildung und der pH-Indikator schlägt zu rot um.

• Ergebnisse:
  • roter Agar: Urease-Aktivität positiv

MIO-Röhrchen

• Nachweis von:
  • Aktive Bewegung (englisch Motility), auch als „Beweglichkeit“ bezeichnet (englisch mobility)
  • Indolbildung
  • Ornithindecarboxylase (Ornithindecarboxylase ODC)

• Zusammensetzung:
  • Tryptophan (Substrat)
  • Ornithin (Substrat)
  • Glucose (Substrat)
  • Bromkresolpurpur (Indikator)

• Reaktionen:
  • Beweglichkeit verursacht eine Trübung des Agars durch die Ausbreitung der Bakterien im Agargel.
  • Tryptophan wird enzymatisch zu Indol abgebaut, das mit dem Kovacs-Reagenz nachweisbar ist; dieses wird jedoch erst nach der Inkubation manuell hinzugegeben.
  • Durch den Abbau von Glucose zu Säuren wird Bromkresolpurpur im Agar gelb gefärbt (pH < 5,6). Wird Ornithin durch Ornithindecarboxylase zum alkalisch reagierenden Putrescin decarboxyliert, steigt der pH wieder an (Realkalisierung) und der Agar wird wieder violett .

• Ergebnisse:
  • nur der Stichkanal ist trübe: keine Beweglichkeit
  • Trübung außerhalb des Stichkanals: bewegliche Bakterien
  • Kovacs-Reagenz verfärbt sich rot: Indolbildung positiv
  • Agar ist violett: ODC-Aktivität positiv
  • Agar ist gelb: ODC-Aktivität negativ

Simmons Citrat-Agar

• Nachweis von:
  • Fähigkeit, Citrat als einzige Energiequelle zu verstoffwechseln

• Zusammensetzung:
  • Natriumcitrat (Substrat)
  • Bromthymolblau (Indikator)

• Reaktionen:
  • Wenn Citrat als Energiequelle genutzt werden kann, steigt der pH-Wert durch den Abbau dieser Säure an und Bromthymolblau wird blau (Ausgangsfarbe ist grün).

• Ergebnisse:
  • grüner Agar: keine Citratverwertung
  • blauer Agar: Citratverwertung

Siehe auch

• Analytical Profile Index